巴贝斯属虫通用PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

巴贝斯属虫通用PCR试剂盒是一款适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增的试剂盒。它采用M-MLV进行反转录反应，能够得到较长的反转录产物。在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。

巴贝斯属虫通用PCR试剂盒中配制的酶均为进口的酶，RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整。反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。该试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

巴贝斯属虫通用PCR试剂盒

巴贝斯属虫通用PCR试剂盒是一种用于检测巴贝斯属虫（Barberella）等细菌的PCR试剂盒。它包含以下主要成分：

1.引物：巴贝斯属虫的特异性引物，用于扩增目标DNA序列。

2.酶：热稳定的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，用于在PCR过程中催化DNA复制。

3.dNTPs：dATP、dTTP、dGTP和dCTP，用于提供PCR反应所需的原料。

4.PCR缓冲液：含有Mg2+、Ca2+等离子体成分的溶液，用于调节PCR反应的环境条件。

5.染料：如SYBR Green I或SYBR Gold，用于实时监测PCR反应过程中的产物扩增情况。

使用巴贝斯属虫通用PCR试剂盒时，需要将待测样本DNA与上述成分混合，然后放入PCR仪中进行扩增。通过电泳观察扩增后的DNA片段大小，以判断是否含有巴贝斯属虫等细菌基因。

应用^[4][5]

巴贝斯属虫通用PCR试剂盒可以用于犬巴贝斯虫和犬埃立克体双重纳米PCR方法的建立及初步应用

建立犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法,为这两种血液原虫病的临床诊断和大规模筛查奠定技术基础。

1. 犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重PCR方法的建立。分别收集犬的阳性或疑似阳性犬巴贝斯虫和犬埃立克体抗凝血样本,提取DNA,分别设计犬巴贝斯虫18s r RNA和犬埃立克体16s r RNA引物,PCR扩增相应的DNA片段,分别进行胶回收,TA克隆至p MD-18T载体,构建重组质粒p MD-BC和p MD-EC,质粒PCR鉴定并测序验证。以阳性质粒p MD-BC和p MD-EC为模板,进行双重PCR扩增并选择最适退火温度。在此基础上,系列稀释质粒模板,再次进行双重PCR,检测其灵敏度。

结果表明,(1)犬巴贝斯虫和犬埃立克体重组质粒p MD-BC和p MD-EC测序结果与Gen Bank公布的相应18s r RNA和16s r RNA核苷酸序列同源性均100%;

(2) 双重PCR退火温度为62℃;

(3) 该体系对巴贝斯虫和埃立克体病原最低核酸检出量分别为2.07×105和1.92×105 copies/μL。

2. 犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法的建立。在前一个实验的基础上,应用纳米PCR试剂盒,对退火温度和引物用量进行了优化,在确定退火温度后,以上述实验同样的方法测定了双重纳米PCR方法的灵敏度;应用犬立克次体、弓形虫、细小病毒和犬瘟热病毒阳性DNA样品为模板,验证了该体系的特异性。此外,收集南宁地区152份犬血样,应用该双重纳米PCR方法对犬巴贝斯虫和犬埃立克体病流行病学进行了调查。

结果表明,(1)成功建立了犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法;退火温度为57℃;

(2) 该双重纳米PCR体系特异性良好,对犬巴贝斯虫和犬埃立克体最低核酸检测量分别为2.07×103copies/μL和1.92×103copies/μL,敏感度比先前双重PCR体系高100倍。

(3)应用该体系对152份临床样本进行流行病学筛查,结果证明该方法切实可行。总而言之,本实验建立了犬巴贝斯虫和犬埃立克体的双重纳米PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高,可用于犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病的临床诊断和大规模流行病学筛查。

参考文献

[1]An update on the treatment of canine monocytic ehrlichiosis(Ehrlichia canis).Mathios E.Mylonakis;;Shimon Harrus;;Edward B.Breitschwerdt.The Veterinary Journal,2019

[2]Renal azotemia and associated clinical and laboratory findings in dogs with Babesia rossi infection.P.Defauw;;S.Daminet;;A.L.Leisewitz;;A.Goddard;;D.Paepe;;L.Duchateau;;J.P.Schoeman.Veterinary Parasitology,2018

[3]Antiprotozoal treatment of canine babesiosis.Gad Baneth.Veterinary Parasitology,2018

[4]Efficacy,safety and tolerance of imidocarb dipropionate versus atovaquone or buparvaquone plus azithromycin used to treat sick dogs naturally infected with the Babesia microti-like piroplasm.Rocío Checa;;Ana Montoya;;Nieves Ortega;;JoséLuis González-Fraga;;Adrián Bartolomé;;Rosa Gálvez;;Valentina Marino;;Guadalupe Miró.Parasites&Vectors,2017

[5]李连燕.犬巴贝斯虫和犬埃立克体双重纳米PCR方法的建立及初步应用[D].广西大学,2021.