大鼠滑膜成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠滑膜成纤维细胞是从大鼠的滑膜组织中分离出来的细胞，而滑膜组织是关节囊的内层，淡红色，平滑闪光，薄而柔润，由疏松结缔组织组成。关节腔内的所有结构，除关节软骨、半月软骨板以外，即便是通过关节腔的肌腱、韧带等均全部为滑膜所包裹。滑膜分泌滑液，在关节活动中起重要作用。

滑膜细胞是构成滑膜层的细胞群体，是维持关节正常功能的重要组织结构，它包埋在颗粒状无定性的基质中，基质内有分散的纤维分布。这些细胞主要分为A型（巨噬样滑膜细胞）、B型（成纤维样滑膜细胞）以及C型（树突细胞样滑膜细胞）。其中，A型和B型是最常见的。

大鼠滑膜成纤维细胞

大鼠滑膜成纤维细胞在关节炎等疾病的研究中具有重要意义。在关节炎等疾病状态下，滑膜成纤维细胞会发生增生和分化，分泌炎性介质和降解酶等，导致关节破坏和功能障碍。通过对大鼠滑膜成纤维细胞的研究，可以深入了解关节炎等疾病的发病机制和治疗方法。

大鼠滑膜成纤维细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）大鼠滑膜成纤维细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）大鼠滑膜成纤维细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．大鼠滑膜成纤维细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）大鼠滑膜成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

大鼠滑膜成纤维细胞可以用于程氏蠲痹汤加减方对佐剂关节炎大鼠滑膜成纤维细胞Beclin1、LC3B表达的影响

探讨程氏蠲痹汤加减方(Modified Cheng’s Juanbi decoction,CJBD)对类风湿关节炎(Rheumatoid Rrthritis,RA)发生作用的机制,观察CJBD高、中、低不同剂量对佐剂关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠的一般状态、体重、双侧足趾容积、多发性关节炎指数(Arthritis index,AI)的变化,以及对血清中细胞因子白细胞介素4(Interleukin 4,IL-4)、白细胞介素17(Interleukin 17,IL-17),滑膜成纤维细胞中Beclin1、LC3B mRNA和蛋白相关指标表达水平的作用,研究CJBD对AA大鼠滑膜成纤维细胞自噬产生的影响,为CJBD治疗RA取得疗效提供可靠的实验依据。

方法:大鼠随机分为正常组、模型组、CJBD低、中、高三个剂量组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组。除了正常组,向其他组的大鼠右后足趾部位,注射0.15ml的弗氏完全佐剂(Freund’s adjuvant complete,CFA)致炎。致炎后第1d,采用病证结合的方式在AA模型的基础上进行风寒湿环境的刺激形成风寒湿痹的中医大鼠模型。模型复制成功后,CJBD低、中、高剂量组大鼠分别给予相应剂量的CJBD药液灌胃;MTX组给予相应剂量的MTX悬混液灌胃;模型组、正常组给予相应剂量的蒸馏水灌胃;各组均持续给药28d。

评估CJBD对实验大鼠在治疗前后的一般状态、体重、双侧足趾容积、AI的影响;酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunoadsorption,ELISA)检测大鼠血清中IL-4、IL-17的水平;实时荧光定量PCR检测大鼠滑膜成纤维细胞中Beclin1、LC3B mRNA的表达水平;免疫蛋白质印记法(Western blotting,WB)检测大鼠滑膜成纤维细胞中Beclin1、LC3B蛋白的表达水平。

结果:1.一般状态和体重比较发现,与正常组相比,治疗前的AA大鼠精神萎靡、饮食饮水减少、致炎侧和继发侧足趾发红肿胀明显、活动受限,并伴有毛发粗糙、鼻部充血等情况,呈进行性加重趋势,体重增长缓慢;与模型组对比,CJBD高、中、低剂量组和MTX组治疗后的AA大鼠一般症状有所缓解,体重增长缓慢得到改善(P<0.05);

2. 双侧足趾容积比较发现,与正常组比较,模型组、MTX组、CJBD高、中、低剂量组给药前的双侧足趾容积显著升高(P<0.05);与模型组对比,CJBD高、中、低剂量组以及MTX组治疗后的AA大鼠双侧足趾容积减小,且CJBD高剂量组优于CJBD中剂量组,CJBD中剂量组优于CJBD低剂量组(P<0.05);

3.AI比较发现,与模型组对比,CJBD高、中、低剂量组和MTX组治疗后的AA大鼠AI评分下降(P<0.05),其中CJBD高剂量组AI评分的下调水平高于MTX组(P<0.05),MTX组与CJBD中剂量组差异无统计学意义(P>0.05),CJBD中剂量组与CJBD低剂量组有差异(P<0.05);

参考文献

[1]Contribution of IL-1β,6 and TNF-αto the form of post-traumatic osteoarthritis induced by“idealized”anterior cruciate ligament reconstruction in a porcine model.Peng-fei Han;;Lei Wei;;Zhi-qing Duan;;Zhi-liang Zhang;;Tao-yu Chen;;Jian-gong Lu;;Rui-peng Zhao;;Xiao-ming Cao;;Peng-cui Li;;Zhi Lv;;Xiao-chun Wei.International Immunopharmacology,2018

[2]Novel treatment strategies in rheumatoid arthritis.Gerd R Burmester;;Janet E Pope.The Lancet,2017

[3]Is rheumatoid arthritis an autoimmune disease?.Karine Chemin;;Lars Klareskog;;Vivianne Malmstr?m.Current Opinion in Rheumatology,2016

[4]Understanding the role of cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.Somaiya Mateen;;Atif Zafar;;Shagufta Moin;;Abdul Qayyum Khan;;Swaleha Zubair.Clinica Chimica Acta,2016

[5]吴亚兰.程氏蠲痹汤加减方对佐剂关节炎大鼠滑膜成纤维细胞Beclin1、LC3B表达的影响[D].安徽中医药大学,2020.