副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒是一种用于检测特定基因（DNA）片断的试剂盒。

该试剂盒主要通过一对波氏杆菌引物介导，在体外对特定基因（DNA）片断进行快速酶促扩增。经过一定数量的热循环扩增后，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的（1+E）n（0<E<1，扩增效率=倍），使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。

副百日咳波氏杆菌

副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒实验过程：

一、副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒试剂准备

1.DNA模板

2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒操作步骤

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×PCR buffer：5μl；dNTP mixl：4μl；引物1（10pM）：2μl；引物2（10PM）：2μl；Taq酶（2U/μl）：1μl；DNA模板（50ng-1μg/μl）：1μl；加ddH2O至：50μl，视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀

应用^[4-5]

副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒可以用于犬支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及fimN基因的克隆、表达和表达蛋白免疫原性分析

犬窝咳是由犬支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)犬腺病毒(CAV)、犬瘟热(CDV)和犬副流感病毒(CPiV)中的一种或几种病原混合感染引起的。本实验主要目的是了解犬支气管败血波氏杆菌在窝咳犬中的分布,分析比较Bb分离株的生物学特性,并同时比较三种病毒在窝咳犬中的检出。

从南京地区和北京地区采集了164份患有窝咳的犬鼻腔拭子进行Bb的分离鉴定,经培养性状、形态学检查、生理生化试验、血清学鉴定及副百日咳波氏杆菌PCR试剂盒鉴定,最终分离到16株Bb,分离率为9.8%,药敏试验结果显示16株细菌生物学特性和对抗生素敏感性基本相同。对16份Bb阳性病料样品进行犬腺病毒、犬瘟热、犬副流感病毒检测,结果表明窝咳犬由Bb引发的几率占10%,和三种病毒混合感染的情况者占81%。

对2006年11月至2008年1月在北京和南京地区分离的16株犬波氏杆菌和一株兔波氏杆菌参考株的fimN基因进行了全长克隆,用MegAlign(DNAStar)比较分析分离株与GenBank中收录的犬波氏杆菌参考株(登录号AF231910)的fimN核苷酸序列,绘制基因进化树。结果表明,16株支气管败血波氏杆菌的fimN基因序列同源性与犬波氏杆菌参考株序列的同源性在99%以上,和兔波氏杆菌参考株的序列同源性也在99%以上,表明南京和北京两地的犬源支气管败血波氏杆菌的fimN核苷酸序列基本无变化。

对克隆载体pMD18T-fimN进行双酶切,将得到的630bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-32a(+)中,构建PETBb-fimN重组质粒表达载体,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在37℃1mM IPTG诱导下该片段获得良好的表达。

经SDS-PAGE鉴定其表达的融合蛋白质约39.4kDa,与预期值一致。免疫转印试验显示,体外表达的该重组蛋白可被兔支气管败血波氏杆菌NK0610株兔抗血清识别。表达蛋白纯化后免疫实验兔,通过琼脂扩散试验测血清抗体效价,结果显示血清的沉淀效价为1:40,表明该重组蛋白具备天然菌毛蛋白N基因的部分抗原表位,为研制CDV的亚单位疫苗提供了侯选材料。

参考文献

[1]Bordetella bronchiseptica infection in pediatric lung transplant recipients.ZarahNer;LawrenceA.Ross;Monica V.Horn;Thomas G.Keens;Eithne F.MacLaughlin;Vaughn A.Starnes;Marlyn S.Woo.Pediatric Transplantation,2003

[2]Characterization of fimN,a new Bordetella bronchiseptica major fimbrial subunit gene.S.A.Kania;;S.Rajeev;;E.H.Burns;;T.F.Odom;;S.M.Holloway;;D.A.Bemis.Gene,2000

[3]Antibiotic susceptibility of canine Bordetella bronchiseptica isolates.A.J Speakman;;S Dawson;;J.E Corkill;;S.H Binns;;C.A Hart;;R.M Gaskell.Veterinary Microbiology,2000

[4]Isolation and characterization of Bordetella bronchiseptica from cats in southern Louisiana.J.D Hoskins;;J Williams;;A.F Roy;;J.C Peters;;P McDonough.Veterinary Immunology and Immunopathology,1998

[5]白雪.犬支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及fimN基因的克隆、表达和表达蛋白免疫原性分析[D].南京农业大学,2009.