无酶细胞消化液的应用

背景^[1-3]

无酶细胞消化液不含胰蛋白酶等蛋白消化酶类，但能有效地使贴壁细胞与培养瓶皿表面脱离而达到分离细胞目的。

不同的细胞消化时间有所不同。如果发现消化不足，可以加入Non-enzyCell Detach Solution重新消化。

无酶细胞消化液(Non-enzyCell DetachSolution)不含胰蛋白酶等蛋白消化酶类，但能有效地使贴壁细胞与培养瓶皿表面脱离而达到分离细胞目的。

无酶细胞消化液

无酶细胞消化液特点是:

1、作用温和;

2、对细胞的损伤和破坏极小，不影响细胞生物学特性，是肿瘤细胞的极好细胞脱壁方法;

3、可以在血清存在的情况下进行消化。消化后的细胞可进行传代培养，亦可用于提取核蛋白和胞浆蛋白、Western Blot、免疫共沉淀等实验，通常室温下10min左右就可以消化下大多数贴壁细胞，该消化液适用于消化肿瘤、脑、肝、肾、肺组织等，尤其适用于上皮组织。

无酶细胞消化液操作步骤:

1.贴壁细胞的消化

①吸除培养液，用无菌PBS、培养液洗涤细胞1次。

②加入少量无酶细胞消化液，略盖过细胞即可(一般按细胞的有效体积的10倍添加)。

③室温放置10min，如置于37℃脱壁反应会加速，直到细胞完全脱壁，不同的细胞消化时间有所不同。亦可显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除消化液。

④加入细胞培养液或5倍体积PBS缓冲液终止反应。如果发现消化不足，则加入无酶细胞消化液重新消化。

⑤1000~2000g离心3~5min，沉淀细胞，弃上清，尽量去除无酶细胞消化液，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

2.组织的消化

①PBS、培养液清洗组织1次，用无菌的刮勺或茶匙将剪碎的组织碎片转移至合适容器。

②按组织有效体积的5~10倍，加入无酶细胞消化液。

③置于37℃作用4~48h，无需振荡，不同的细胞消化时间有所不同。对于较难分解的肿瘤细胞，可作用5天或更长时间，但应重新用消化液悬浮。

④吹打组织碎片数次，释放松散的细胞，轻轻晃动培养瓶或皿，倒置显微镜下检查分离情况当细胞量少和/或在组织碎片中仍可见细胞时，需要继续消化。

⑤1000~2000g离心3~5min，沉淀细胞，弃上清，尽量去除无酶细胞消化液，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

应用^[4-5]

无酶细胞消化液可以用于对虾淋巴组织的原代和传代细胞培养及其永生性转化研究

为找到对虾淋巴组织原代培养细胞单层的有效传代方法，本文设计并比较了13种传代方法的传代培养效果，其中包括基于8种消化液的9种消化方法：胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、中性蛋白酶、链霉蛋白酶E、透明质酸酶、弹性蛋白酶、HyQTase、ECDS(Enzyme-free Cell Dissociation Solution)和HyQTase/ECDS（无酶细胞消化液）混合酶消化法，

2种物理方法：冷PBS(4℃)处理和细胞刮刮洗，以及消化液和物理方法相结合的2种传代方法:HyQTase和ECDS分别与4℃PBS处理相结合。

通过比较消化时细胞的脱壁率、消化时间、传代后细胞的形态和再贴壁率等，我们发现非哺乳动物来源的消化酶HyQTase和非酶细胞消化液ECDS（无酶细胞消化液）表现出较好的消化效果。HyQTase原液作用于细胞单层6分钟可以将80%89%的细胞从培养皿上消化下来，细胞的再贴壁率可达49.5±1.5%，但是稀释后的HyQTase(50%and25%原液)作用810mins仍表现为较低的细胞脱壁率(60%69%)和再贴壁率(31.7±3.8%和25.6±4.0%)。ECDS消化液得到了相似的消化效果。ECDS原液消化时的细胞脱壁率和再贴壁率(80%89%；50.3±2.7%)明显高于其两种稀释液(50%和25%)消化时细胞的脱壁率(60%69%)和再贴壁率(35..5±5.0%和28.0±1.5%)。

尽管4℃PBS单独使用时其消化效果并不明显，但是当其与HyQTase和ECDS（无酶细胞消化液）原液溶液结合使用时，HyQTase和ECDS消化效果得到显著的提高，消化时间也都由原来的6分钟缩短为4.5分钟，细胞的脱壁率达到90%100%，细胞的再贴壁率也明显提高，HyQTase为54.1±2.0%，ECDS为60.2±4.9%。我们还发现，常用的0.25%胰蛋白酶溶液可以很轻松地将对虾细胞从培养皿上消化下来，但是消化下来的细胞难以贴壁，大量死亡。

然而，当胰蛋白酶溶液浓度降为0.125%时，在细胞脱壁率为80%90%条件下，对虾细胞的再贴壁率明显提高，可达45.7±1.0%。但是，更低浓度的胰蛋白酶溶液(0.05%)需要更长的消化时间(10分钟)，细胞的脱壁率才能达到60%69%，而细胞的再贴壁率也相对较低(21.0±2.0%)。其它五种消化酶溶液包括胶原酶Ⅱ、中性蛋白酶、透明质酸酶、链霉蛋白酶E和弹性蛋白酶的消化效果很差，消化时间都相对较长(2035分钟)，细胞的脱壁率大约为60%79%，细胞的再贴壁率大都在10%20%之间，只有1mg·mL-1的胶原酶Ⅱ的贴壁率较好，可达36.2±7.3%。4℃PBS冷处理和细胞刮刮洗法单独使用时，传代效果都较差，细胞的再贴壁率都约为25%左右。

由于体外培养对虾淋巴细胞无明显的增殖现象，因而传代使得培养细胞的密度不断降低。因此，目前采用HyQTase和ECDS（无酶细胞消化液）分别与4℃PBS处理相结合的消化方法仅能将对虾淋巴组织原代培养细胞连续传代2次，此后细胞开始退化、脱壁甚至死亡。

参考文献

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[4]Development of cell culture system from the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii(de Man).Mukunda Goswami;;Wazir S.Lakra;;T.Rajaswaminathan;;Gourav Rathore.Molecular Biology Reports,2010

[5]韩倩.对虾淋巴组织的原代和传代细胞培养及其永生性转化研究[D].中国海洋大学,2014.