短螺旋体通用PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

短螺旋体通用PCR试剂盒是一种用于检测短螺旋体的分子生物学试剂盒。

短螺旋体是一类具有致病性的微生物，包括多种血清型，如莱姆病、人腹股沟肉芽肿等。短螺旋体通用PCR试剂盒可以通过检测短螺旋体特异性基因序列，快速、准确地检测出不同血清型的短螺旋体，对于诊断和治疗短螺旋体感染具有重要意义。

短螺旋体通用PCR试剂盒

短螺旋体通用PCR试剂盒使用方法：

注：所有试剂使用前需完全解冻，混合均匀，6,000rpm离心数秒后使用。

1.样本处理（样本处理区）

待检样本的核酸提取可采用病毒RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等，具体提取方法请参照相关说明书；阳性质控品及阴性质控品无需提取，可直接使用。

2.扩增试剂准备（PCR前准备区）

取N个（N=阴性质控品+待检样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入FMD RT-PCR反应液19μl、RT-PCR酶1μl(也可根据每头份用量计算N+1份FMD RT-PCR反应液、RT-PCR酶所需总量，两者混匀离心后分装20μl至单个PCR反应管)。

组分每头份用量FMD RT-PCR反应液19μlRT-PCR酶。

1.将所有PCR反应管于6,000rpm离心30s，转移至样本处理区。

2.加样（样本处理区）

3.在上述的PCR反应管中分别加入待检样本RNA提取物、阴性质控品和阳性质控品各5μl，盖紧管盖，于6,000rpm离心10s，转移至扩增区。

应用^[4-5]

短螺旋体通用PCR试剂盒可以用于猪痢疾短螺旋体的分离、鉴定与血清抗体ELISA检测方法的建立

猪痢疾常用的诊断方法主要依赖于病猪临床症状和组织病变的观察、以及PCR检测技术,但由于不同感染猪群的临床症状和组织病变差异较大,使临床诊断举步为艰；PCR检测只能确定样本中是否存在B.hyo的核酸,但不能获得活的病原体,因此迫切需要建立一套快速又准确的诊断猪群感染B.hyo’晴况的检测方法。

利用PCR检测临床样本中B.hyo的保守的NADH oxidase(nox)基因,同时选择鉴别培养基BAM-SR(Blood Agarose Medium with Spectinomycin and Rifampicin,改良的含有壮观霉素和利福平的血平板),采用厌氧袋厌氧培养法对PCR检测阳性样本进行B.hyo的分离培养,对分离培养物进行银染法快速镜检,以及进行16S rRNA基因序列比较与分析。成功的建立了一套实验室PCR检测结合厌氧培养的快速分离鉴定B.hyo的方法。从采集的254份临床猪大肠黏膜和粪便样品中,PCR检测出B.hyo阳性样本13份,成功分离鉴定出1株B.hyo命名为SHB1。利用大肠杆菌表达系统,融合表达了具有种属特异性和免疫原性的猪痢疾短螺旋体外膜脂蛋白Bhlp30.7.优化了Bhlp30.7的表达与纯化条件。

将纯化的Bhlp30.7蛋白作为包被抗原,建立了检测猪血清中B.hyo抗体的间接ELISA方法,并优化了间接ELISA检测方法的各项条件。本实验融合表达了分子量为30.7KDa的目的蛋白；确立了浓度为0.1M IPTG的诱导浓度和6h的诱导时间；选择了含100mM咪唑的结合缓冲液纯化蛋白；经方阵滴定实验,确定2μg/mL的抗原为包被浓度,待检血清稀释度的稀释度是200倍。

利用融合表达的Bhlp30.7蛋白作为间接ELISA检测方法的包被抗原,对上海周边地区28个猪场共计609份猪血清样本进行检测。对照各个猪场的猪痢疾病史和PCR检测结果,使用阳性判断值法(cut-off value)处理检测结果,利用PCR检测SD阴性和无SD病史猪场来源的血清的相对OD值,计算得到cut-off值为4.28(P<0.05),确定了相对OD值为4.49的疑似阳性临界点。从609份猪血清样本中,共检测出阳性46例占7.56%,疑似38例占6.24%,阴性525例占86.2%。从种群角度来分析,母猪阳性率占母猪种群的14.1%,仔猪阳性率占仔猪种群的0.75%,育肥猪占其种群的1.2%。

参考文献

[1]Evaluation of recombinant Bhlp29.7 as an ELISA antigen for detecting pig herds with swine dysentery.Tom La;;Nyree D.Phillips;;David J.Hampson.Veterinary Microbiology,2008

[2]Consecutive pathological and immunological alterations during experimentally induced swine dysentery–A study performed by repeated endoscopy and biopsy samplings through an intestinal cannula..Research in Veterinary Science,2006

[3]Development of a multiplex‐PCR for rapid detection of the enteric pathogens Lawsonia intracellularis,Brachyspira hyodysenteriae,and Brachyspira pilosicoli in porcine faeces.T.La;A.M.Collins;N.D.Phillips;A.Oksa;D.J.Hampson.Letters in Applied Microbiology,2006

[4]The distribution of bmpB,a gene encoding a 29.7kDa lipoprotein with homology to MetQ,in Brachyspira hyodysenteriae and related species.T.La;;P.Tan;;N.D.Phillips;;D.J.Hampson.Veterinary Microbiology,2005

[5]寇亚辉.猪痢疾短螺旋体的分离、鉴定与血清抗体ELISA检测方法的建立[D].南京农业大学,2014.