人膀胱移行细胞癌细胞的应用

背景^[1-3]

人膀胱移行细胞癌细胞是一种来源于膀胱的肿瘤细胞，是膀胱癌的主要类型之一。T24细胞源自病人的转移性细胞腺癌，对T24和相关细胞株有细胞毒性。T24细胞群体倍增时间为19小时，含ras(H-ras)癌基因。

人膀胱移行细胞癌细胞

人膀胱移行细胞癌细胞培养步骤：

一．人膀胱移行细胞癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）膀胱移行细胞癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3膀胱移行细胞癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏人膀胱移行细胞癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人膀胱移行细胞癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人膀胱移行细胞癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4-5]

人膀胱移行细胞癌细胞可以用于腺病毒介导诱导型一氧化氮合酶基因转染对膀胱移行细胞癌细胞的影响

研究试图通过腺病毒介导的方法将外源性iNOS导入膀胱移行细胞癌细胞T24中,上调细胞内iNOS基因的表达,促使细胞释放大量NO,提高细胞内NO的浓度,从而干扰细胞的生长周期,诱导细胞发生凋亡。以腺病毒介导的基因转移技术在肿瘤基因治疗中应用较为普遍,目的基因可以整合到病毒基因组而后随病毒一起感染宿主细胞。腺病毒具有嗜膀胱细胞的特性,而膀胱又是一个半开放器官,这使应用腺病毒载体进行膀胱癌的基因治疗成为可能。基因治疗联合现有治疗方法寻找对抗膀胱癌复发的新思路和新途径已成为研究热点。

采用联合小剂量化疗药物(HCPT、THP)对人膀胱移行细胞癌T24细胞进行体外杀伤,并进行比较,为腺病毒介导的iNOS的基因疗法联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。本课题由三部分组成。

目的：利用腺病毒表达系统构建携带iNOS基因的重组腺病毒载体,并获得rAd-iNOS重组腺病毒,用于后续对T24细胞作用的研究。本实验在先前工作的基础上,将iNOS基因开放阅读框(open reading frame,ORF)片段先亚克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,然后体外重组至腺病毒载体pAd/BL-DEST,构建重组腺病毒载体,并转染HEK293细胞进行腺病毒包装,从而获得重组腺病毒rAd-iNOS。

方法：为确保模板质粒pReceive-M29-iNOS的正确性,将模板质粒进行序列测定。测序正确后,双酶切pReceive-M29-iNOS及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收iNOS片段的带和线状pYr-adshuttle-1载体带,连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,摇菌扩增,提取重组质粒pYr-adshuttle-1-iNOS,进行酶切鉴定和DNA测序。将鉴定正确的重组质粒采用LR体外同源重组将iNOS表达框亚克隆至腺病毒表达载体pAd/BL-DEST,PacI酶切重组腺病毒载体pAd-iNOS,使重组腺病毒载体线性化后转染包装细胞HEK 293,包装成重组腺病毒rAd-iNOS,PCR鉴定并测定病毒滴度。

结果：经测序,模板质粒pReceive-M29-iNOS的DNA序列分析结果与预期结果完全相符,与NCBI公布的iNOS的ORF进行序列比对,正确性高达100%；经酶切分析、测序结果表明腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-iNOS和腺病毒载体pAd-iNOS构建成功；经PCR鉴定,重组腺病毒rAd-iNOS包装成功,其滴度达5.8×108PFU/ml。

结论：成功构建了重组腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-iNOS和重组腺病毒载体pAd-iNOS后,采用HEK293细胞进行腺病毒包装,最终获得重组腺病毒rAd-iNOS。

参考文献

[1]Recent developments in advanced urothelial cancer.Karen Giselle Chee;;Angelo Cambio;;Primo N Lara.Current Opinion in Urology,2005

[2]Intravesical gemcitabine therapy for superficial transitional cell carcinoma:Results of a Phase II prospective multicenter study.Riccardo Bartoletti;;Tommaso Cai;;Mauro Gacci;;Gianluca Giubilei;;Fabrizio Viggiani;;Giorgio Santelli;;Fabio Repetti;;Stefano Nerozzi;;Paolo Ghezzi;;Michele Sisani.Urology,2005

[3]Molecular markers for predicting recurrence,progression and outcomes of bladder cancer(do the poster boys need new posters?).Brian Duggan;;Kate Williamson.Current Opinion in Urology,2004

[4]Neoadjuvant Chemotherapy with Docetaxel and Cisplatin in Patients with High-Risk Resectable Bladder Carcinoma:Long Term Results.A Bamias;;C Deliveliotis;;A Karayiannis;;I Varkarakis;;I Zervas;;D Pantazopoulos;;D Gika;;M.A Dimopoulos.European Urology,2004

[5]曾青.腺病毒介导诱导型一氧化氮合酶基因转染对膀胱移行细胞癌细胞的影响[D].中南大学,2010.