TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系于1974年从一个未分化的移行细胞癌建系，该患者在切除肿瘤之前有4个月的血尿病史。后来发现了向骨髓的转移。超微结构研究表明存在微绒毛和脂质体，但未观察到桥粒。

TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系

一．TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM（推荐YJ-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4-5]

TCCSUP人膀胱移行细胞癌贴壁细胞系可以用于顺铂相关cGAS-STING信号激活对膀胱癌增殖的影响及其机制研究

探讨膀胱癌顺铂治疗免疫效应,有助于深入理解顺铂的综合作用机制。

研究目的：

1.探讨顺铂相关免疫效应与膀胱癌内源性c GAS-STING通路激活的相关性及其调控机制；

2.探索顺铂诱导的膀胱癌内源性c GAS-STING信号激活对膀胱癌增殖的影响及其机制；

研究方法：1.首先通过RNA转录组测序联合生物信息学分析发现,顺铂处理激活了T24膀胱癌细胞系中多种免疫炎症相关通路,且这些免疫炎症通路的激活可能与c GAS-STING信号的激活相关。结合公共数据库我们探索了STING蛋白在膀胱癌中的基础表达水平。通过实时荧光定量PCR,蛋白印迹实验,酶联免疫吸附实验,报告基因实验,免疫荧光以及流式细胞分析技术等来验证了顺铂处理后膀胱癌细胞系中c GAS-STING通路及其下游信号是否激活。通过小干扰沉默STING或使用STING特异抑制剂H151来验证T24、TCCSUP膀胱癌细胞系顺铂相关的免疫效应是否显著减弱。

2. 结合公共数据库探索膀胱癌中STING激活上游蛋白c GAS的基础表达水平。通过免疫荧光,亚细胞组分蛋白印迹试验探索顺铂处理后膀胱癌细胞系的DNA损伤修复状态;探索顺铂处理后膀胱癌细胞系中c GAS的总体表达水平,细胞定位以及染色质绑定c GAS蛋白水平是否改变。

3. 使用CCK-8试验以及克隆形成试验探索STING蛋白敲低后膀胱癌细胞系的体外增殖水平是否改变。结合TCGA数据库分析c GAS-STING中关键蛋白的中位数表达水平是否与患者的整体生存以及无病生存相关。

4. 使用慢病毒转染构建STING-Knockdown及STING-WT稳转MB49小鼠来源膀胱癌细胞株。在C57BL/6J小鼠中构建MB49膀胱癌皮下移植模型,比较PBS联合STING-Knockdown组,PBS联合STING-WT组,顺铂联合STING-Knockdown组,顺铂联合STING-WT组小鼠皮下瘤增殖情况,并通过流式细胞技术分析CD3+CD45+,CD8+CD45+,CD11c+MHCII+以及F4/80+CD11b+免疫细胞浸润比例。结合上述结果分析顺铂相关STING信号激活对小鼠膀胱癌皮下移植瘤增殖的影响及其可能机制。

最后使用CIBERSORT分析TCGA数据库中接受过膀胱癌顺铂化疗患者的预后与肿瘤微环境免疫细胞浸润水平的相关性。

研究结果1.顺铂诱导膀胱癌细胞产生免疫效应,主要体现为I型干扰素分泌等免疫通路的富集以及包括IL-6,INF-β等细胞因子、趋化因子分泌显著增加,这种免疫效应和c GAS-STING通路的激活密切相关。顺铂诱导的T24、TCCSUP膀胱癌细胞系中ds DNA累积以及染色质绑定c GAS蛋白的释放可能是激活c GAS-STING信号并导致下游特殊免疫效应的重要原因。

2. 沉默或抑制STING不影响T24、TCCSUP膀胱癌细胞系体外增殖水平。在C57BL/6J小鼠皮下移植瘤实验中,顺铂激活的膀胱癌细胞内源性c GAS-STING信号抑制了的小鼠膀胱癌皮下瘤的增殖。同时膀胱癌内源性c GAS-STING信号的激活诱导了小鼠膀胱癌皮下瘤免疫微环境浸润性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+细胞增加。

研究结论：顺铂可通过诱导DNA损伤以及促进染色质绑定c GAS蛋白释放等方式激活膀胱癌内源性c GAS-STING信号。顺铂诱导的膀胱癌内源性c GAS-STING信号的激活促进了包括IL-6,INF-β在内的细胞因子分泌,并诱导了小鼠膀胱癌皮下瘤肿瘤微环境中浸润性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+细胞增加。这些结果将为晚期膀胱癌治疗中顺铂联合免疫疗法的尝试提供新的思路。

参考文献

[1] Structural mechanism of cGAS inhibition by the nucleosome..Pathare Ganesh R;Decout Alexiane;Glück Selene;Cavadini Simone;Makasheva Kristina;Hovius Ruud;Kempf Georg;Weiss Joscha;Kozicka Zuzanna;Guey Baptiste;Melenec Pauline;Fierz Beat;Thom?Nicolas H;Ablasser Andrea.Nature,2020

[2]Structural basis for sequestration and autoinhibition of cGAS by chromatin..Michalski Sebastian;de Oliveira Mann Carina C;Stafford Che;Witte Gregor;Bartho Joseph;Lammens Katja;Hornung Veit;Hopfner KarlPeter.Nature,2020

[3]Structural basis of nucleosome-dependent cGAS inhibition..Boyer Joshua A;Spangler Cathy J;Strauss Joshua D;Cesmat Andrew P;Liu Pengda;McGinty Robert K;Zhang Qi.Science(New York,N.Y.),2020

[4]Structural basis for the inhibition of cGAS by nucleosomes..Kujirai Tomoya;Zierhut Christian;Takizawa Yoshimasa;Kim Ryan;Negishi Lumi;Uruma Nobuki;Hirai Seiya;Funabiki Hironori;Kurumizaka Hitoshi.Science(New York,N.Y.),2020

[5]陈枭翼.顺铂相关cGAS-STING信号激活对膀胱癌增殖的影响及其机制研究[D].浙江大学,2023.