大鼠睾丸支持细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠睾丸支持细胞又称Sertoli细胞，是生精细胞的支架，为其提供必需的营养物质，能合成与分泌雄激素结合蛋白，为其提供高浓度的雄激素环境等，还具有构成血-睾屏障，形成睾丸内微环境，调节精子发生等功能。

睾丸支持细胞是存在于雄性睾丸间质中的主要细胞类型，其主要功能是分泌和合成睾丸酮，睾丸酮在刺激精子发生、精子成熟及性功能的维持等方面具有重要作用。目前，以睾丸支持细胞为靶向的药物研究备受关注。体外培养的睾丸支持细胞能直接反应药物对该细胞作用的特点，使分离纯化睾丸支持细胞成为必要的前提条件。

大鼠睾丸支持细胞

大鼠睾丸支持细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。**天换液并检查细胞密度。

2）大鼠睾丸支持细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠睾丸支持细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠睾丸支持细胞可以用于妊娠期镉暴露对父系子代大鼠睾丸支持细胞的影响及相关基因DNA甲基化作用的研究

妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸支持细胞的影响目的:妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸支持细胞的影响。

方法:清洁级SD大鼠250±10g,雌雄1:1或1:2合笼饲养,次日清晨检查阴栓或进行阴道涂片检查,发现阴栓或涂片发现精子记为妊娠期第0天,将孕鼠(F0代)随机分成4组,氯化镉(0、0.5、1、2mg/kg/day)灌胃染毒,染毒时间为妊娠天直至分娩(即1-21天)。

F0代孕鼠自然分娩产下F1代雄鼠,常规喂养至5、21和56天(PND5、PND21、PND56)后,随机抽取每组F1代成年雄鼠与外来健康的雌鼠1:2合笼交配产生F2代,F2代雄鼠常规喂养后以同样的方式产生F3代成年雄鼠。

收集F1、F2及F3代血清和睾丸,行组织病理学检查,经H&E染色后进行曲细精管(Seminiferous Tubule,ST)直径测量及Johnsen评分评价睾丸生长发育情况;透射电镜观察细胞超微结构;ELISA方法测定血清中促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)、卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)激素水平;免疫组织化学方法进行睾丸组织细胞FSHR定位及表达量检测。

结果:1、妊娠期镉暴露对子代大鼠生长发育和睾丸组织病理学的影响

1.1基础数据显示:与对照组相比,F1代大鼠体重仅在PND5时,2mg/kg剂量组体重增加(P<0.05);F2代大鼠体重仅在PND21时,1mg/kg剂量组体重增加(P<0.05)。

1.2 H&E染色显示:F1代大鼠睾丸仅在PND5时,1mg/kg剂量组睾丸曲细精管直径减少(P<0.05);F2代大鼠睾丸仅在PND56时,0.5mg/kg剂量组睾丸曲细精管直径减少(P<0.05),在2mg/kg睾丸曲细精管直径增加(P<0.05);F3代大鼠睾丸0.5mg/kg曲细精管直径增加(P<0.05),其他各个剂量组Johnsen评分增加(P<0.05);光学显微镜下显示三代各时期睾丸支持细胞未见异常变化,曲细精管内均可见完好精子发生。

2、妊娠期镉暴露对子代睾丸支持细胞超微结构的影响透射电镜显示在F1代大鼠PND5、PND56睾丸支持细胞在对照组细胞膜完整、核膜完整与周围细胞联系紧密,剂量组观察到睾丸支持细胞超微结构发现改变,出现明显空泡化、水肿、坏死,并与周围细胞间隙增大。

3、妊娠期镉暴露对雄性子代血清激素的影响血清激素水平检测显示:F1代结果:Gn RH在PND21,0.5mg/kg水平发生上升(P<0.05)。FSH在PND5时0.5mg/kg水平上升(P<0.05);在PND21时各个剂量组血清中FSH水平下降(P<0.05)。F2代结果:FSH在PND5,0.5mg/kg水平上升(P<0.05)。F3代结果:Gn RH、FSH在F3代未见明显变化。

4、妊娠期镉暴露对子代睾丸支持细胞分泌FSHR蛋白的影响妊娠期镉暴露后F1代PND56睾丸组织经免疫组织化学染色后观察到支持细胞分布在曲细精管基底面,未见游离支持细胞,正常组FSHR分布于基底面,蛋白AOD值为0.5090,剂量组FSHR蛋白同样分布于曲细精管基底面,蛋白AOD值为0.4011,与对照组相比,FSHR蛋白AOD值降低(P<0.05)。

参考文献

[1]Prenatal exposure to excess chromium attenuates transcription factors regulating expression of androgen and follicle stimulating hormone receptors in Sertoli cells of prepuberal rats.Navaneethabalakrishnan Shobana;;Mani Kathiresh Kumar;;Ajit Kumar Navin;;Mohammad Abdulkader Akbarsha;;Mariajoseph Michael Aruldhas.Chemico-Biological Interactions,2020

[2]CpG Site-Specific Regulation of Metallothionein-1 Gene Expression.Ogushi Shoko;Yoshida Yuya;Nakanishi Tsuyoshi;Kimura Tomoki.International Journal of Molecular Sciences,2020

[3]Paternal cadmium exposure increases the susceptibility to diet-induced testicular injury and spermatogenic disorders in mouse offspring.Yuan Nan;;Song-Jia Yi;;Hua-Long Zhu;;Yong-Wei Xiong;;Xue-Ting Shi;;Xue-Lin Cao;;Cheng Zhang;;Lan Gao;;Ling-Li Zhao;;Jun Zhang;;De-Xiang Xu;;Hua Wang.Chemosphere,2020

[4]Multigenerational effects of cadmium on the lifespan and fertility of Drosophila melanogaster.Xingran Yang;;Yan Han;;Yun Mu;;Pingping Yang;;Wei Gu;;Min Zhang.Chemosphere,2020

[5]李小琴.妊娠期镉暴露对父系子代大鼠睾丸支持细胞的影响及相关基因DNA甲基化作用的研究[D].福建医科大学,2022.