MGC80-3细胞系|人胃癌细胞的应用

背景^[1-3]

MGC80-3细胞系|人胃癌细胞是从一位53岁男性原发性胃低分化粘液样腺癌患者建立的；MGC80-3细胞可在免疫抑制的Wistar雄幼大鼠皮下移植成功。

MGC80-3细胞系|人胃癌细胞

MGC80-3细胞系|人胃癌细胞培养方法：

1、收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、MGC80-3细胞系|人胃癌细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、MGC80-3细胞系|人胃癌细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

4、MGC80-3细胞系|人胃癌细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

应用^[4][5]

MGC80-3细胞系|人胃癌细胞可以用于环孢素A诱导胃癌MGC80-3细胞凋亡及其相关分子机制研究

选择环孢素A对人胃癌细胞株MGC80-3增殖抑制的影响及其诱导细胞凋亡，并进一步探讨其诱导细胞凋亡的相关机制，为环孢素A更好地应用于临床发挥抗肿瘤效应提供理论依据。

方法：MTT实验检测环孢素A对MGC80-3细胞生长和增殖的影响，采用PI染色通过流式细胞仪(FCM)检测环孢素A对MGC80-3细胞生长周期的阻滞作用；acridine orange/ethidium bromide(AO/EB)荧光染色和透射电子显微镜观察MGC80-3细胞形态和线粒体形态在给药前后的变化。FCM检测AnnexinV-FITC/PI双染后肿瘤细胞的凋亡发生率以及环孢素A处理MGC80-3细胞后细胞内活性氧(ROS)的含量，Western blotting法检测细胞内P-gp、NF-κB p65蛋白的表达水平。

结果(1)MTT实验结果表明环孢素A在一定时间下(24h、48h、72h)和一定浓度下(24h时25.0μΜ、48h和72h时15.025.0μM)对人胃癌MGC80-3细胞有明显增殖抑制作用，呈现时效、量效依赖关系；环孢素A作用MGC80-3细胞72h的IC50值为20.7uM。流式细胞仪检测显示环孢素A各给药组G0/G1期细胞比例均高于对照组，呈现G0/G1周期阻滞作用。

(2) 荧光显微镜观察环孢素A处理MGC80-3细胞后形态变化，AO/EB染色结果显示正常细胞染色呈现一致均匀的绿色；凋亡细胞或损伤细胞呈现橘黄色荧光，细胞形态发生变化，细胞核染色质凝聚、固缩，并见有细胞碎片，细胞密度明显减少。环孢素A处理后细胞呈现明显的凋亡状态。

(3) 透视显微镜观察显示环孢素A作用MGC80-3细胞后，细胞出现固缩变圆，线粒体嵴变少变短或消失，细胞核发生典型核染色质固缩的的凋亡形态学改变。

(4) 环孢素A处理细胞48h后，细胞内活性氧(ROS)含量明显增加，与未给药组比较有显著性差异(p<0.01)。

(5) 流式细胞仪检测结果表明，环孢素A作用MGC80-3细胞后，细胞凋亡率随环孢素A浓度增加和作用时间延长而升高，差异与对照组相比有统计学意义(p<0.05，p<0.01)。

(6) Western blotting检测发现，环孢素A作用MGC80-3细胞后，细胞凋亡内P-gp和NF-κB p65蛋白表达水平明显受到抑制，呈现浓度依赖关系。

结论：环孢素A能够在一定时间和浓度范围内对人胃癌MGC80-3细胞的增殖有抑制作用并诱导肿瘤细胞发生凋亡；其诱导细胞凋亡机制可能与线粒体发生氧化应激和下调P-gp、NF-κB p65的蛋白表达有关；通过抑制NF-κB信号通路、线粒体凋亡路径抑制肿瘤细胞的增殖。

参考文献

[1]Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species.Paola Venditti;;Lisa Di Stefano;;Sergio Di Meo.Mitochondrion,2013

[2]Cyclosporin A suppresses prostate cancer cell growth through CaMKKβ/AMPK-mediated inhibition of mTORC1 signaling.Chae Ryun Lee;;Jung Nyeo Chun;;Sang-Yeob Kim;;Soonbum Park;;Su-Hwa Kim;;Eun-Jung Park;;In-San Kim;;Nam-Hyuk Cho;;In-Gyu Kim;;Insuk So;;Tae Woo Kim;;Ju-Hong Jeon.Biochemical Pharmacology,2012

[3]Rosiglitazone Reverses Mitomycin C Resistance in Human Gastric Cancer Cells.Li Zhang;;Jian-Feng Hu;;Guo-Qing Li;;Xiang Xiao;;Qi Su.The American Journal of the Medical Sciences,2012

[4]Cyclosporine A enables vincristine-induced apoptosis during reversal of multidrug resistance phenotype in chronic myeloid leukemia cells.Paloma Souza;Flavia Cunha Vasconcelos;Luis Silva;Raquel Maia.Tumor Biology,2012

[5]黄军祥.环孢素A诱导胃癌MGC80-3细胞凋亡及其相关分子机制研究[D].安徽医科大学,2014.