细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒是一种经典的细胞凋亡检测方法。这种试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）双染的方法，可以快速简便地检测细胞凋亡。

细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒

细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒操作步骤：

1.细胞样品的制备：

⑴贴壁细胞：

①小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。

②用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

③收集上述细胞悬液到离心管内，4℃1000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。

④加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。

⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

⑵悬浮细胞：

①4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。

②加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。

③小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2.配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4℃保存备用。

3.重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×106细胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。

4.Hoechst 33258/PI染色：

⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，轻轻混匀，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。

⑵两步法：

①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15 min

②置于冰水中冷却后，4℃1000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。

③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。

④加入5μl PI Stain，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。

5.细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前4℃1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。

细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细胞呈低蓝光/高红光。

应用^[4][5]

细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒可以用于甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的研究

甘草素抑制肿瘤细胞生长及诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究目的:探讨甘草素(liquiritigenin)对两株肿瘤细胞生长的抑制作用及对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用的影响。

方法:本研究采用体外培养人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的方法,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察甘草素对肿瘤细胞增殖的影响;Hoechst染色法和电镜观察甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡的形态变化;流式细胞仪检测甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡率的变化情况。

结果:甘草素对Lovo结肠癌细胞作用24、48和72h时各剂量组出现生长抑制作用,其最高抑制率分别为15.4%、57.1%和84.7%;对SMMC-7721肝癌细胞作用24、48和72h时,各剂量组都已出现生长抑制作用,最高抑制率分别达到85.6%、94.2%和91.3%,并呈现明显的剂量-效应关系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721细胞12、24、48和72h,Hoechst染色观察可见细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;透射电镜观察可见0.4mM甘草素作用细胞72h后,细胞染色质浓缩、空泡。流式细胞仪检测结果发现,甘草素可诱导SMMC-7721细胞凋亡,并呈时间-剂量效应关系,甘草素剂量为0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的细胞发生凋亡。

结论:甘草素对人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的生长均有抑制作用,其中对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用更加明显,并能诱导SMMC-7721肝癌细胞细胞凋亡。

参考文献

[1]Eupatilin,a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants,induces cell cycle arrest in ras-transformed human mammary epithelial cells.Do-Hee Kim;;Hye-Kyung Na;;Tae Young Oh;;Won-Bae Kim;;Young-Joon Surh.Biochemical Pharmacology,2004

[2]Acacetin-induced cell cycle arrest and apoptosis in human non-small cell lung cancer A549 cells.Ya-Ling Hsu;;Po-Lin Kuo;;Chi-Feng Liu;;Chun-Ching Lin.Cancer Letters,2004

[3]Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics:significance for their chemopreventive and anticancer properties.Giuseppe Galati;;Peter J O'Brien.Free Radical Biology and Medicine,2004

[4]Expression of survivin mRNA associates with apoptosis,proliferationand histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma.Soichiro Morinaga;;Yoshiyasu Nakamura;;Naoki Ishiwa;;Takaki Yoshikawa;;Yoshikazu Noguchi;;Yuji Yamamoto;;Yasushi Rino;;Toshio Imada;;Yoshinori Takanashi;;Makoto Akaike;;Yukio Sugimasa;;Shoji Takemiya.Oncology Reports,2004

[5]张世蘋.甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的研究[D].南京医科大学,2009.