杂交瘤细胞抗体基因测序

背景^[1-6]

杂交瘤细胞抗体基因测序使用专业的兼并引物设计（degenerate primer）和测序方案，同时优化经济成本和时间成本，为客户提供快速准确的抗体可变区域以及全长基因测序服务。尽管杂交瘤细胞能够无限增殖并表达抗体，但是在长时间的细胞增殖和蛋白表达可能导致抗体基因发生突变以致表达的抗体失效。因此，获取杂交瘤细胞单克隆抗体基因序列对于大规模稳定表达单克隆抗体尤为重要。为了更好解决科研用户的需求，杂交瘤细胞抗体基因测序可基于PCR扩增技术的单克隆抗体基因测序服务。

相较于对单克隆抗体氨基酸序列的测序，单克隆抗体基因测序可以提供更准确更可靠的结果，并且能够更为准确地区分亮氨酸/异亮氨酸等在质谱鉴定中较难区分氨基酸。杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至死亡。

而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得抗体；从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该抗体，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。同时还可以使用获得的测序结果进行专利等知识产权方面的申请审批。有时为了进一步大规模生产或进行人源化等生物工程操作/修饰，很有必要了解杂交瘤所表达的抗体对应的基因序列以进一步进行生物工程操作与生产。

服务具体内容：

1. 提取杂交瘤细胞总 RNA

2. RT-PCR 反应

3. 抗体轻链VL， CL克隆

4. 抗体重链 VH， CH1， CH2， CH3克隆

5. 抗体轻链 重链 T 载体构建

6. 生物信息学分析测序结果，剔除非功能抗体基因

7. 结果报告

服务报告内容包括：1实验步骤（中英文）；2. DNA测序结果；3. 单克隆抗体轻链和重链可变区基因序列信息；4. DNA凝胶图像；5. 原始数据

应用^[7][8]

1.为申请保护性专利提供有权单抗序列信息

2.为永久保留单克隆抗体序列信息，防止杂交瘤细胞丢失单抗信息

3.帮助目标细胞株的选择，表达纯度更高的重组单克隆抗体

4.可以缩短杂交瘤细胞克隆化耗时过程，加速单克隆抗体产生速度

例如用杂交瘤技术将基因工程人γ－干扰素（ｒＩＦＮ－γ）免疫的Ｂ淋巴细胞与ｓｐ２／０鼠骨髓瘤细胞融合，建立了３株抗ｒＩＦＮ－γ杂交瘤细胞株。这些细胞株经两年多的传代培养仍保持稳定分泌抗体的能力，并与ｒＩＦＮ－γ及新型γ－干扰素呈特异性反应，可用于亲和层析纯化γ－干扰素．

5.筛选亲和力成熟，进一步提高单抗的亲和力

比如在分泌马铃薯Y病毒中和抗体杂交瘤细胞系的筛选中已经用酶联免疫吸附试验证实，Ｄ７３、Ｄ９０和Ａ６９三个杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体均能够与马铃薯Ｙ病毒株系ＰＶＹ￣ｏ、ＰＶＹ￣Ｎ和ＰＶＹ￣ｃ发生反应，但以Ｄ７３的亲和性为最强。为了进一步研究Ｄ７３杂交瘤细胞系作为分离马铃薯Ｙ病毒中和抗体基因的材料的可行性，对其分泌的抗体轻链和重链的亚类进行了抗体基因测序鉴定，

6.用于构建嵌合抗体或人源化抗体

参考文献

[1]Characterization of Biological Activities of Brucella melitensis Lipopolysaccharide[J].Gantsetseg Tumurkhuu,Naoki Koide,Kazuko Takahashi,Ferdaus Hassan,Shamima Islam,Hiroyasu Ito,Isamu Mori,Tomoaki Yoshida,Takashi Yokochi.Microbiology and Immunology.2006(6)

[2]DNA polymorphism in the omp25/omp31 family of Brucella spp.:identification of a 1.7-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 15.1-kb genomic island,absent from Brucella ovis,related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide[J].Nieves Vizcaíno,Paola Caro-Hernández,Axel Cloeckaert,Luis Fernández-Lago.Microbes and Infection.2004(9)

[3]The recombinant Omp31 from Brucella melitensis alone or associated with rough lipopolysaccharide induces protection against Brucella ovis infection in BALB/c mice[J].Silvia M Estein,Juliana Cassataro,Nieves Vizcaíno,Michel S Zygmunt,Axel Cloeckaert,Raúl A Bowden.Microbes and Infection.2003(2)

[4]Major outer membrane proteins of Brucella spp.:past,present and future[J].Veterinary Microbiology.2002(1)

[5]Selection of Phage-displayed Peptides Recognised by Monoclonal Antibodies Directed against the Lipopolysaccharide of Brucella[J].Pascal Mertens,David Walgraffe,Thierry Laurent,Nathalie Deschrevel,Jean-Jacques Letesson,Xavier de Bolle.International Reviews of Immunology.2001(2)

[6]Identification of protective outer membrane antigens of Brucella ovis by passive immunization of mice with monoclonal antibodies[J].Raúl A Bowden,Silvia M Estein,Michel S Zygmunt,Gérard Dubray,Axel Cloeckaert.Microbes and Infection.2000(5)

[7]丛进阳,丁宝玉,沈金玉.抗基因工程人rIFN-γ杂交瘤细胞株的建立[J].清华大学学报(自然科学版),1992(03):109-116

[8]刘德虎,郭军,陈三风,梁华,王海扬.植物抗体基因工程：I．分泌马铃薯Y病毒中和抗体杂交瘤细胞系的筛选[J].高技术通讯,1995(02):42-44.