小鼠黑色素瘤细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠黑色素瘤细胞是B16-F0细胞的亚系，源自黑色素瘤C57BL/6J荷瘤小鼠的皮肤；B16-F1细胞可产生黑色素。

小鼠黑色素瘤细胞

小鼠黑色素瘤细胞培养操作:

1)复苏小鼠黑色素瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠黑色素瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)小鼠黑色素瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

小鼠黑色素瘤细胞可以用于SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究

基于前期研究发现白藜芦醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞中SHCBP1的表达水平的结果,采用CCK-8、流式细胞术、Western Blot、Ed U染色等方法阐明白藜芦醇在抑制小鼠黑色素瘤(B16)细胞的分子机制,并进一步阐明SHCBP1在B16细胞中的生物学作用。

本研究主要获得实验结果如下:1、白藜芦醇抑制B16细胞增殖、细胞集落形成和细胞迁移。这种影响是由于白藜芦醇抑制B16细胞中ERK及AKT信号通路,并促进细胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表达。同时发现白藜芦醇抑制B16细胞中SHCBP1蛋白的表达。

2、SHCBP1在B16细胞中本底表达较高。通过获得干扰SHCBP1的B16细胞株,利用转录组测序分析差异基因KEGG通路,发现差异基因主要富集在细胞增殖、凋亡、氧化及炎症相关通路,说明SHCBP1的确影响B16细胞增殖。

3、在B16细胞中单独干扰和超表达SHCBP1,结果发现SHCBP1加速B16细胞G1/S期进程,促进ERK和AKT的磷酸化,进一步影响Cyclin D1和P21的表达水平,从而调控细胞增殖过程。

4、分别在SHCBP1干扰和超表达的情况下,用白藜芦醇处理B16细胞,结果发现,白藜芦醇抑制SHCBP1的表达,调控ERK信号通路从而影响B16细胞的细胞增殖,另一方面,白藜芦醇也通过AKT信号通路发挥调控B16细胞增殖效应。

结论:本研究阐明白藜芦醇通过抑制SHCBP1/ERK和AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及迁移能力。为白藜芦醇临床治疗提供实验支撑,SHCBP1作为治疗黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供理论依据和实验基础。

参考文献

[1]SHCBP1 interacting with EOGT enhances O-GlcNAcylation of NOTCH1 and promotes the development of pancreatic cancer.Yang Can;Hu Jian-Fei;Zhan Qian;Wang Zu-Wei;Li Ge;Pan Jing-Jing;Huang Long;Liao Cheng-Yu;Huang Yi;Tian Yi-Feng;Shen Bai-Yong;Chen Jiang-Zhi;Wang Yao-Dong;Chen Shi.Genomics,2021

[2]FGF13 interaction with SHCBP1 activates AKT-GSK3α/βsignaling and promotes the proliferation of A549 cells.Lu Hongzhao;Yin Meichen;Wang Ling;Cheng Jia;Cheng Wei;An Huanping;Zhang Tao.Cancer Biology&Therapy,2020

[3]NRASQ61K melanoma tumor formation is reduced by p38-MAPK14 activation in zebrafish models and NRAS-mutated human melanoma cells..Banik Ishani;Cheng Phil F;Dooley Christopher M;Travnickova Jana;Merteroglu Munise;Dummer Reinhard;Patton Elizabeth E;BuschNentwich Elisabeth M;Levesque Mitchell P.Pigment cell&melanoma research,2020

[4]Curcumol inhibits the proliferation and metastasis of melanoma via the miR-152-3p/PI3K/AKT and ERK/NF-κB signaling pathways..Ning Ning;;Liu Sulai;;Liu Xiehong;;Tian Zeyu;;Jiang Yu;;Yu Nanhui;;Tan Boyu;;Feng Hao;;Feng Xing;;Zou Lianhong.Journal of Cancer,2020

[5]孙志阳.SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究[D].陕西理工大学,2021.