人整合SV40基因的乳腺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

人整合SV40基因的乳腺上皮细胞由E.V.Gaffney及其同事从一位没有乳癌家族史的供者乳汁中建立，培养出来的细胞染色体组型在第7代时就不正常；电镜照片显示有微丝、张力原纤维和桥粒；Southern转移表明有整合型SV40病毒基因，不可以当作正常细胞。

人整合SV40基因的乳腺上皮细胞培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

人整合SV40基因的乳腺上皮细胞

人整合SV40基因的乳腺上皮细胞处理：

1）冻存人整合SV40基因的乳腺上皮细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人整合SV40基因的乳腺上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人整合SV40基因的乳腺上皮细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人整合SV40基因的乳腺上皮细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

人整合SV40基因的乳腺上皮细胞可以用于BMP9通过下调CTGF抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移

研究BMP9对乳腺癌细胞骨转移的作用及其分子机制。

方法:RT-PCR检测临床乳腺癌及其癌旁组织,以及转移能力不同的几株乳腺癌细胞系中BMP9的表达;以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染该细胞,制备高表达BMP9的重组MDA-MB-231/BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的空载腺病毒感染该细胞制备MDA-MB-231/GFP,联合空白MDA-MB-231共同作为对照组;通过平板集落形成实验、细胞划痕实验﹑Transwell侵袭实验检测重组MDA-MB-231/BMP9细胞侵袭及迁移能力。

Real Time PCR检测肿瘤骨转移相关基因CTGF、ID1、CXCR4在MDA-MB-231/BMP9中的表达;制备CTGF条件培养基刺激MDA-MB-231/BMP9,通过细胞划痕实验﹑Transwell侵袭实验检测在外源性CTGF蛋白的条件下重组MDA-MB-231/BMP9细胞的侵袭及迁移能力改变。

在裸鼠胫骨骨膜下分别注射上述乳腺癌细胞,制备乳腺癌骨转移模型,观察BMP9是否能抑制乳腺癌细胞的骨转移,免疫组化分析CTGF在转移骨内的表达改变情况;通过BMP9、CTGF两种腺病毒共感染MDA-MB-231细胞,制备高表达BMP9和CTGF的重组MDA-MB-231/BMP9/CTGF细胞,以此作为实验组,同时以MDA-MB-231/BMP9/RFP作为对照组,观察在CTGF存在的情况下,两组细胞所致裸鼠长骨溶骨性损伤的差异。

结果:在6对临床乳腺癌及癌旁组织中,BMP9在其中5例癌组织中表达缺失,而在相应癌旁组织中有较高表达,1例在癌组织和癌旁组织均有表达,但癌旁组织中BMP9表达明显高于癌组织;在转移能力不同的乳腺癌细胞系中,高转移能力的MDA-MB-231中表达缺失,转移能力低的MCF7和整合SV40的乳腺上皮细胞HBL-100中BMP9有较高表达。

选择MDA-MB-231细胞作为研究对象,通过体外BMP9腺病毒感染制备高表达BMP9的MDA-MB-231/BMP9重组细胞作为实验组。与对照组细胞相比,实验组细胞中BMP9 mRNA表达水平明显增高;集落形成率由对照的(90.6±2.5)%与(85.6±3.5)%显著下降至(57.3±4.5)%(P<0.05);划痕愈合率由对照的(95.4±3.1)%与(92.5±2.4)%下降至(74.0±3.6)%(P<0.05);Transwell实验中穿膜细胞数由对照的(255.3±16.1)个与(267.3±14.9)个下降至(150.3±14.6)个(P<0.05);定量PCR结果显示MDA-MB-231/BMP9细胞中肿瘤骨转移相关基因CTGF表达下调。

通过CTGF条件培养基刺激MDA-MB-231/BMP9细胞,在外源性CTGF蛋白存在的条件下,划痕实验结果显示实验组MDA-MB-231/BMP9+CTGF细胞划痕愈合率由对照组MDA-MB-231/BMP9+GFP组的(32.2±1.6)%上升至(85.3±3.1)%(P<0.05),Transwell实验中穿膜细胞数由对照MDA-MB-231/BMP9+GFP穿膜细胞数(135.8±10.1)个上升至(248.5±21.6)个(P<0.05)。

裸鼠胫骨分别注射实验组与对照组细胞,制备乳腺癌骨转移模型,发现BMP9能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231溶骨性转移,免疫组化结果显示CTGF在MDA-MB-231/BMP9所致的转移骨组织中表达下调(P<0.05),恢复CTGF表达后MDA-MB-231/BMP9/CTGF的溶骨性区域明显大于MDA-MB-231/BMP9/RFP组。

参考文献

[1]Expression of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)in breastcancer cells is associated with increased migration and angiogenesis.Wenwen Chien;;James O'Kelly;;Daning Lu;;Amanda Leiter;;Julia Sohn;;Dong Yin;;Beth Karlan;;Jay Vadgama;;Karen Lyons;;H.Koeffler.International Journal of Oncology,2011

[2]Connective tissue growth factor enhances the migration of gastric cancer through downregulation of E‐cadherin via the NF‐κB pathway.ZhengfaMao;XiaoyanMa;YefeiRong;LeiCui;XuqingWang;WenchuanWu;JianxinZhang;DayongJin.Cancer Science,2010

[3]Bone morphogenetic protein‐10(BMP‐10)inhibits aggressiveness of breast cancer cells and correlates with poor prognosis in breast cancer.LinYe;SivanBokobza;JinLi;MuhammadMoazzam;JinfengChen;Robert E.Mansel;Wen G.Jiang.Cancer Science,2010

[4]Connective tissue growth factor associated with oncogenic activities and drug resistance in glioblastoma multiforme.DongYin;WeikaiChen;JamesO'Kelly;DaningLu;MichelleHam;Ngan B.Doan;DongXie;CharlesWang;JayVadgama;Jonathan W.Said;Keith L.Black;H.PhillipKoeffler.Int.J.Cancer,2010

[5]王科.BMP9通过下调CTGF抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移[D].重庆医科大学,2011.