人永生化肝细胞的应用

背景^[1-3]

人永生化肝细胞取自男性供体，经过SV40永生化处理，细胞呈上皮样贴壁生长。

人永生化肝细胞

人永生化肝细胞培养操作：

1)复苏人永生化肝细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人永生化肝细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人永生化肝细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人永生化肝细胞可以用于冻存人源永生化肝细胞微囊用于生物人工肝治疗的研究

选择功能的人源性永生化肝细胞制作微囊,以大规模于液氮中冻存后,在新型生物人工肝支持系统中检测肝衰竭病人血浆对肝细胞的毒性作用以及肝细胞对肝衰竭病人血浆的清除效果,为生物型人工肝的临床试验奠定基础。

方法1.永生化人源肝细胞的功能评价。利用MTT、实时定量PCR、免疫荧光和Western blot及ELISA等检测增殖及功能。

2. 将反应器流化培养的永生化肝细胞系微囊与静态培养肝细胞系微囊、二维培养肝细胞作对比,比较细胞中与功能相关Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特异性核受体基因、CYP450蛋白表达的变化。检测肝细胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成确定冻存条件、冻存时间以及复苏孵育条件并且评价微囊化肝细胞大规模冻存效果。

3. 体外初步评价生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血浆,将复苏并孵育后的肝细胞微囊加入到肝衰竭病人血浆中培养24h,观察肝衰竭病人血浆对微囊内肝细胞活性和功能的影响以及肝衰竭病人血浆内重要物质成分的变化。

结果1HepLi3细胞增殖能力,可以进行大规模的培养,获得高数量的细胞,而且其在功能上明显优于其他永生化肝细胞。

2. 微囊化和流化培养的肝细胞在培养过程中保持很好的活性；微囊化的培养方式可以促进肝细胞特异基因及蛋白的表达；此种培养方式可能是通过抑制细胞内磷酸激酶活性来提高肝细胞特异性功能的。

3. 确定微囊制作完成孵育2h后进行冻存操作；冻存复苏后孵育2h,其功能可恢复很好,且将体积扩大到50毫升不会影响肝细胞的冻存后的功能。

4. 肝衰竭病人血浆造成肝细胞活率下降12%,但不影响其作为种子细胞的应用。而且微囊化肝细胞系可以改变肝衰竭病人血浆中物质成分,促进其体内内环境的稳定,为其临床应用奠定基础。

结论1.本实验室制作的HepLi3可作为生物人工肝的种子细胞有效发挥肝特异性功能。

2. 确定了微囊的制作,肝细胞冻存及复苏的条件,并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促进肝细胞功能的原因。

3. 大规模冻存微囊化肝细胞后,细胞活性保持良好,可以为生物人工肝提供种子细胞库。

4.利用肝衰竭病人血浆及生物反应器证明冻存后的微囊化肝细胞可降低重肝血浆中的谷丙转氨酶和直接胆红素。

参考文献

[1]The impact of partial manganese superoxide dismutase(SOD2)-deficiency on mitochondrial oxidant stress,DNA fragmentation and liver injury during acetaminophen hepatotoxicity.Anup Ramachandran;;Margitta Lebofsky;;Steven A.Weinman;;Hartmut Jaeschke.Toxicology and Applied Pharmacology,2011

[2]Loss of Caspase-8 Protects Mice Against Inflammation-Related Hepatocarcinogenesis but Induces Non-Apoptotic Liver Injury..Gastroenterology,2011

[3]Establishment and Characterization of Immortalized Porcine Hepatocytes for the Study of Hepatocyte Xenotransplantation.X.Pan;;W.Du;;X.Yu;;G.Sheng;;H.Cao;;C.Yu;;G.Lv;;H.Huang;;Y.Chen;;J.Li;;L.J.Li.Transplantation Proceedings,2010

[4]Rat hepatocyte spheroids formed by rocked technique maintain differentiated hepatocyte gene expression and function.Colleen M.Brophy;;Jennifer L.Luebke‐Wheeler;;Bruce P.Amiot;;Harris Khan;;Rory P.Remmel;;Piero Rinaldo;;Scott L.Nyberg.Hepatology,2009

[5]杨英.冻存人源永生化肝细胞微囊用于生物人工肝治疗的研究[D].浙江大学,2014.