一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法

水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物——苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。

4-氨基水杨酸在40℃以上的水溶液中不稳定，分解并放出二氧化碳而成为间氨基酚。现有技术中分解4-氨基水杨酸主要依靠加热手段，工厂化应用会耗费大量热能，并且随着逆反应的进行而使分解效率低下。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，包括以下步骤：

Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；

Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；

Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；

Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；

Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1L PBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及 18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～ 30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。

此方法的优势

本发明取代传统降解4-氨基水杨酸需经高温的技术条件，使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。