LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。肿瘤起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮和神经实质细胞，即神经元。

LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系

脑肿瘤中胶质细胞瘤发病率最高，约占40.49%，综合发病年龄高峰在30-40岁，或10-20岁。大脑半球发生的胶质瘤约占全部胶质瘤的51.4%，以星形细胞瘤为最多，其次是胶质细胞瘤和少枝胶质细胞瘤，脑室系统也是胶质瘤较多的发生部位，占胶质瘤总数的23.9%，主要为管膜瘤，髓母细胞瘤，星形细胞瘤，小脑胶质瘤占胶质瘤总数的13%，主要为星形细胞瘤。

胶质细胞瘤,也称神经胶质细胞瘤,发生于神经外胚叶组织,是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤。过去认为,胶质细胞瘤多见于成年人;目前发现,本病在其他年龄段均有发病率逐渐增高的趋势。

LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系培养操作

1）复苏LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

LN-18人神经胶质瘤贴壁细胞系可以用于STAT3及其相关因子在白藜芦醇抗原发性脑肿瘤作用中的意义分析

在髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞和胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)对STAT3及其相关因子LIF、c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1、Bcl-2表达情况的影响,以及STAT3和细胞的生长、分化、凋亡与耐药之间的关系,探讨白藜芦醇在抗髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤作用中的分子机制,为改善髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤的临床化学治疗现状提供新的实验室指标和理论根据。

方法：人髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞和胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养液中,以5×104/ml的初始细胞密度接种于Φ60mm和Φ100mm的培养皿中,24小时后用100μM白藜芦醇进行处理。将白藜芦醇溶解于二甲基亚砜(DMSO,demethylsulfoxide)溶液中,以5mM的浓度储存,使用前稀释到100μM。用100μM白藜芦醇(resveratrol,Res),处理细胞48小时,观察其对细胞的作用效果。为便于观察细胞形态学特征和进行免疫细胞化学(ICC)染色,将无菌盖玻片预先置于培养皿底部制备细胞爬片,待取出时用100%冷丙酮进行固定。同时收集细胞悬液并离心沉淀以用于RNA和蛋白质的提取。

采用免疫细胞化学、RT-PCR和Western-blotting等方法系统检测髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞和胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中STAT3及其相关因子LIF、c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1和Bcl-2在100μM白藜芦醇处理前后表达水平的改变、细胞内的分布状况及其与分化和凋亡的关系。

结果：1)用100μM白藜芦醇处理细胞48h时后,对白藜芦醇敏感的髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞形态发生明显改变,而白藜芦醇并不能引起胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞形态的变化。

2) 在髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞中,白藜芦醇可以下调STAT3的表达水平并且使其核易位程度明显减少,而在胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中,白藜芦醇可使STAT3发生核易位但对STAT3表达水平的影响很小。

3) 白藜芦醇可以明显上调髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞中LIF的表达水平,而对胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中LIF表达水平的影响甚小。

4) 在髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞中,100μM白藜芦醇可不同程度地下调c-Myc、Survivin、Cox-2和CyclinD1的表达水平,上调Bcl-2的表达水平,而在胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中100μM白藜芦醇对c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1和Bcl-2表达水平皆无明显影响。

结论：1)本研究证实100μtM白藜芦醇在诱导髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞发生分化和调亡的同时,抑制了STAT3通路的活化,而在胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞中白藜芦醇未呈现其抗肿瘤作用但是STAT3发生核易位。

2) 髓母细胞瘤细胞系UW228-3细胞对白藜芦醇的作用较敏感,而胶质母细胞瘤细胞系LN-18细胞对白藜芦醇的作用则具有耐药性。

3)本研究进一步证实了对STAT3信号转导通路的抑制是白藜芦醇抗原发性脑肿瘤作用的重要分子机制。

参考文献

[1]Perivascular Nitric Oxide Activates Notch Signaling and Promotes Stem-like Character in PDGF-Induced Glioma Cells[J].Nikki Charles;;Tatsuya Ozawa;;Massimo Squatrito;;Anne-Marie Bleau;;Cameron W.Brennan;;Dolores Hambardzumyan;;Eric C.Holland.Cell Stem Cell,2010(2)

[2]An RNAi Screen Identifies TRRAP as a Regulator of Brain Tumor-Initiating Cell Differentiation[J].Heiko Wurdak;;Shoutian Zhu;;Angelica Romero;;Mihaela Lorger;;James Watson;;Chih-yuan Chiang;;Jay Zhang;;Vanita S.Natu;;Luke L.Lairson;;John R.Walker;;Christopher M.Trussell;;Griffith R.Harsh;;Hannes Vogel;;Brunhilde Felding-Habermann;;Anthony P.Orth;;Loren J.Miraglia;;Daniel R.Rines;;Stephen L.Skirboll;;Peter G.Schultz.Cell Stem Cell,2010(1)

[3]Integrated Genomic Analysis Identifies Clinically Relevant Subtypes of Glioblastoma Characterized by Abnormalities in PDGFRA,IDH1,EGFR,and NF1[J].Roel G.W.Verhaak;;Katherine A.Hoadley;;Elizabeth Purdom;;Victoria Wang;;Yuan Qi;;Matthew D.Wilkerson;;C.Ryan Miller;;Li Ding;;Todd Golub;;Jill P.Mesirov;;Gabriele Alexe;;Michael Lawrence;;Michael O'Kelly;;Pablo Tamayo;;Barbara A.Weir;;Stacey Gabriel;;Wendy Winckler;;Supriya Gupta;;Lakshmi Jakkula;;Heidi S.Feiler;;J.Graeme Hodgson;;C.David James;;Jann N.Sarkaria;;Cameron Brennan;;Ari Kahn;;Paul T.Spellman;;Richard K.Wilson;;Terence P.Speed;;Joe W.Gray;;Matthew Meyerson;;Gad Getz;;Charles M.Perou;;D.Neil Hayes.Cancer Cell,2010(1)

[4]MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells[J].Jakub Godlewski;;Michal O.Nowicki;;Agnieszka Bronisz;;Gerard Nuovo;;Jeff Palatini;;Michael De Lay;;James Van Brocklyn;;Michael C.Ostrowski;;E.Antonio Chiocca;;Sean E.Lawler.Molecular Cell,2010(5)

[5]王建民.STAT3及其相关因子在白藜芦醇抗原发性脑肿瘤作用中的意义分析[D].大连医科大学,2010.