NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系来源于一个淋巴结转移患者。细胞均一性的部分缺失p53蛋白，并缺少p53蛋白表达。细胞可以合成0.1pmol/毫克蛋白的NMB蛋白，而不合成促胃液释放肽(GRP)。

NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系

NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640基础培养基86%

优质胎牛血清10%

P/S青霉素-链霉素1%

GlutaMAX-1谷氨酰胺1%

HEPES 1M Buffer solution 1%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠1%

注意：该细胞生长过程中培养基容易变黄需要及时换液。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系处理：

1）冻存NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

NCI-H1299人非小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

利用体内噬菌体展示技术筛选与人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞结合的小分子多肽并在体内外鉴定其结合特异性及靶向性。

方法:1.将人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞接种于裸鼠体内,制备荷瘤裸鼠模型,用噬菌体展示随机环七肽库对荷瘤裸鼠进行3轮体内筛选。免疫组织化学法鉴定噬菌体在肿瘤组织及正常对照组织的分布情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的结合亲和力,鉴定阳性单克隆噬菌体。

2. 提取阳性单克隆噬菌体DNA进行测序获得外源多肽的氨基酸序列,将重复率最高的序列合成靶向肽NSP1,并进行异硫氰酸荧光素(fluorescein,FITC)标记合成荧光探针FITC-NSP1。通过肽与噬菌体的竞争抑制实验鉴定所合成的靶向肽与NCI-H1299细胞的结合特异性。

3. CCK8法检测荧光探针FITC-NSP1对NCI-H1299细胞增殖活性的影响;细胞划痕实验和Transwell实验检测荧光探针FITC-NSP1对NCI-H1299细胞迁移、侵袭的影响。

4. 通过细胞免疫荧光实验在倒置荧光显微镜下观察FITC-NSP1与细胞的结合情况鉴定FITC-NSP1对NCI-H1299细胞的结合特异性;流式细胞术检测FITC-NSP1对NCI-H1299细胞的结合特异性。

5. 通过小动物活体成像实验检测荧光探针FITC-NSP1在体内对肿瘤组织的靶向性,并检测荧光探针的最适浓度以及成像时间。分离小鼠肿瘤组织及正常组织进行离体实验,进一步鉴定荧光探针的靶向性。

结果:1.噬菌体肽库在荷瘤裸鼠体内经过三轮筛选,与NCI-H1299细胞特异性结合的噬菌体克隆得到富集。第3轮筛选后噬菌体在肿瘤组织的回收率是首轮的341.3倍,富集效果明显。

2. 免疫组织化学结果显示,肿瘤组织中富集的噬菌体随每一轮体内筛选的进行而增加,第3轮筛选后,与肿瘤组织结合的噬菌体明显多于正常组织。

3. ELISA结果显示随机挑取的30个噬菌体克隆中有20个是阳性噬菌体克隆(亲和力>2.5)。

4. 阳性噬菌体克隆的测序结果显示序列CTNESIGTC重复率最高,且与数据库中已知氨基酸序列无相似性。将此序列合成靶向肽并命名为NSP1,同时进行FITC标记,合成靶向荧光探针FITC-NSP1和随机对照荧光探针FITC-sv NSP1。

5. 肽与噬菌体的竞争性抑制实验显示靶向肽NSP1可以和相应的阳性噬菌体克隆竞争结合NCI-H1299细胞。

6. CCK8结果显示FITC-NSP1对NCI-H1299细胞增殖无明显影响;细胞划痕实验及Transwell实验结果显示FITC-NSP1在各检测时间段均不会对NCI-H1299细胞迁移、侵袭产生影响。

7. 细胞免疫荧光实验结果显示FITC-NSP1与NCI-H1299细胞结合的荧光强度为103.553±8.412,而随机对照荧光探针FITC-sv NSP1与NCI-H1299细胞结合的荧光强度为9.653±0.880,两者差异具有统计学意义(P<0.01),此外FITC-NSP1不与其他癌细胞及正常细胞结合(P<0.01),表明FITC-NSP1对NCI-H1299细胞具有特异性。

8. 流式细胞术结果显示FITC-NSP1标记NCI-H1299细胞的阳性百分比为70.54±2.15,明显高于其他细胞(P<0.01),随机对照荧光探针FITC-sv NSP1标记的NCI-H1299细胞百分比为7.22±0.36,与FITC-NSP1相比差异具有统计学意义(P<0.001)。

9. 小动物活体成像结果显示FITC-NSP1在体内会逐渐累积在肿瘤部位,具有靶向性,且在4h时肿瘤组织的荧光强度达到,离体实验结果显示FITC-NSP1不会富集在其他正常组织。

结论:本研究采用体内噬菌体展示技术筛选得到与NCI-H1299细胞特异结合的小肽NSP1,并在体内体外鉴定NSP1光学分子探针与肺癌细胞的结合特异性和靶向性,为非小细胞肺癌的早期诊断和靶向治疗的研究奠定了基础。

参考文献

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[5]左琪.人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞特异性结合肽的筛选及鉴定[D].山西医科大学,2021.