人T淋巴细胞白血病细胞的应用

背景^[1-3]

人T淋巴细胞白血病细胞是由A.F.Gazdar于1981年从一名53岁患有塞扎莱综合症的白人男性外周血中分离并建立。HuT78细胞具有成熟T细胞的诱导－辅助特性。HuT78细胞的表面能提出具有生物活性的IL-2。

人T淋巴细胞白血病细胞

人T淋巴细胞白血病细胞培养步骤

一．人T淋巴细胞白血病细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备人T淋巴细胞白血病细胞基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）人T淋巴细胞白血病细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人T淋巴细胞白血病细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人T淋巴细胞白血病细胞处理：

1）复苏人T淋巴细胞白血病细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人T淋巴细胞白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人T淋巴细胞白血病细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人T淋巴细胞白血病细胞可以用于白藜芦醇对人T淋巴白血病细胞（Hut78）增殖和凋亡的影响及其下调C-myc蛋白的表达

急性白血病是血液系统最常见恶性肿瘤之一,常表现为白血病细胞在骨髓及其它造血组织中异常克隆性的增生,从而使得恶性白血病细胞抑制正常的造血系统。目前,临床上应用化疗或造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation)对白血病患者进行治疗,可以有效的治愈一部分患者,但仍存在相当大一部分患者会出现难治性白血病或复发的情况。

这可能与白血病的多药耐药性有相当大的关联,且目前临床用药缺乏特异性,杀伤白血病细胞的同时也会造成正常组织受损,其副作用较大。另一方面,造血干细胞移植治疗花费较大,且移植后并发症严重影响患者的生活质量,其中,严重的移植物抗宿主疾病(GVHD)会危及患者生命,这在一定程度上限制其临床应用。

因此寻找新的治疗药物及治疗靶点是当前研究的重要课题。在急性髓系白血病和急性T淋巴细胞白血病中均可观察到C-myc蛋白表达增高,高表达的C-myc蛋白与白血病的发生和预后相关。

在该蛋白的高表达患者中会有白细胞以及CD34+或者CD33+细胞计数的增多,且伴随肝脏浸润、脾肿大、低缓解率。Myc家族作为转录因子通过其调节基因表达的能力在细胞的生长和增殖中发挥重要作用。原癌基因Myc的激活或扩增与肿瘤的相关的常见事件之一。

该基因在急性髓系白血病经常被激活,并且在诱导白血病发生中发挥重要作用,在急性淋巴细胞白血病中该基因表达上调也经常被报道。本研究的口的旨在观察白藜芦醇(Res)对白血病细胞增殖及凋亡的影响,了解其抗白血病效应的机制,探讨白藜芦醇对人T淋巴白血病细胞(Hut78)的增殖及凋亡的影响,并观察不同浓度白藜芦醇对Hut78细胞C-myc蛋白表达的影响,从而初步探讨白藜芦醇抗白血病效应的作用机制。

材料和方法：对人T淋巴白血病细胞(Hut78)进行培养,并采用该细胞作为白藜芦醇的作用靶细胞,用CCK-8法检测不同浓度白藜芦醇处理后Hut78细胞的增殖情况,。用流式细胞学(Annexin-V)分析经不同浓度白藜芦醇处理不同时间后Hut78细胞的凋亡情况。采用Western blot方法检测细胞中C-myc蛋白的变化。结果：CCK-8法检测发现白藜芦醇在一定范围内显著抑制Hut78细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性,白藜芦醇作用于Hut78细胞24小时后的半浓度抑制率即IC50为98.7μmol/L。

流式细胞分析表明,白藜芦醇可诱导Hut78细胞凋亡,并随药物浓度增加凋亡细胞增多,100μmol/L白藜芦醇作用于细胞24小时凋亡率为(54.43±2.66)%、200μmol/L白藜芦醇作用下细胞凋亡率(63.90±2.55)%。药物处理细胞48h后,100μmol/LRes作用细胞凋亡率为(78.90±1.46)%、200μmol/L白藜芦醇处理后凋亡率为(91.97±2.67)%。Western blot方法检测到细胞中C-myc蛋白的表达显著下降。

结论：白藜芦醇具有明显的抗白血病效应,可以以时间-浓度依赖性的抑制白血病细胞增殖。能够有效的诱导白血病细胞凋亡。白藜芦醇可以下调C-myc蛋白的表达量,其抗白血病效应可能与该作用机制相关。

参考文献

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