人绒毛膜癌细胞的应用

背景^[1-3]

人绒毛膜癌细胞是一株超三倍体人类细胞株。取样于男性，其典型染色体数为71，发生率为34%，多倍体率为2.6%。t(4;11)(p15;q13),i(13q),t(10p15q),del(18)(q21),和6个其他标记在大多数细胞中常见，另有两个标记在一些细胞中可见。在一个N14和两个N22中可见大卫星。N2,N5,和N9有4个拷贝，而N7,N13,N18,N21和X为单拷贝。Q-带检测法可以检测到单个Y染色体。

人绒毛膜癌细胞

人绒毛膜癌细胞培养步骤

人绒毛膜癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

准备MEM培养基(GIBCO,添加NaHCO3 1.5g/L，丙tong酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

人绒毛膜癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

人绒毛膜癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

人绒毛膜癌细胞处理：

复苏人绒毛膜癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

人绒毛膜癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人绒毛膜癌细胞1-2次。

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人绒毛膜癌细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

应用^[4][5]

人绒毛膜癌细胞可以用于SPOP通过促进KIF23和DHX9的降解抑制绒毛膜癌的侵袭和迁移能力

寻找绒毛膜癌中SPOP泛素化底物及SPOP与泛素化底物调控绒癌的机制。

方法:(1)首先将已构建的过表达SPOP和干扰SPOP的慢病毒载体转染到绒毛膜癌JAR细胞中,采用q RT-PCR和Western blot实验验证其效率。结合label-free泛素化修饰定量蛋白质组学结果、SBC基序、前期SPOP研究结果及绒癌高度侵袭性的特点,筛选相关蛋白。

(2) 采用Western blot实验检测绒毛外滋养层细胞HTR-8/Svneo、绒毛膜癌JAR细胞和JEG3细胞中KIF23的表达情况,免疫荧光实验检测KIF23的定位。

(3) 免疫共沉淀法和Western blot实验检测SPOP与驱动蛋白家族成员23(KIF23)间的相关性。

(4) 使用小干扰RNA基因沉默KIF23,采用q RT-PCR和Western blot实验筛选出干扰效率的KIF23-si RNA。采用CCK8法、平板克隆形成实验和Western Blot实验及Transwell侵袭迁移实验探究KIF23对JAR细胞增殖、侵袭和迁移能力影响以及Akt/GSK3β信号通路中蛋白Akt、GSK3β的磷酸化水平变化情况。

(5) 随后将label-free泛素化修饰定量蛋白质组学分析结果、免疫共沉淀实验联合质谱结果和SBC基序相结合筛选相关蛋白。

(6) 在HTR-8/Svneo细胞、JAR细胞和JEG3细胞中通过Western blot实验检测核DNA解旋酶Ⅱ和RNA解旋酶A(DHX9)的表达,免疫荧光实验检测其定位。

(7) 通过免疫共沉淀实验检测JAR细胞和JEG3细胞中SPOP与DHX9的内源性作用;在JAR细胞中分别构建过表达Flag-SPOP或HADHX9细胞模型;293T细胞中构建共表达Flag-SPOP及HA-DHX9细胞模型;293T细胞中构建共表达Flag-SPOP及HA-DHX9-△SBC细胞模型,均采用免疫共沉淀实验探究两者之间的相互作用关系;

(8) 后续采用q RT-PCR、Western blot实验和内源性泛素化实验用于观察SPOP对DHX9降解和泛素化的影响。

(9) 构建DHX9基因沉默的JAR细胞模型,并采用q RT-PCR、Western blot实验验证其干扰效率。采用q RT-PCR、Western blot实验和侵袭迁移实验观察SPOP与DHX9间的相关性对JAR细胞侵袭迁移能力及EMT相关蛋白(N-Cadherin,vimentin,E-Cadherin,cytokeratin 8)表达的影响。

结果:(1)构建过表达和敲低SPOP的JAR细胞模型,并从m RNA水平和蛋白水平验证了模型构建成功。结合相关实验结果,筛选出驱动蛋白KIF23(Treat/Control>1.50)。

(2) 与HTR-8/Svneo细胞相比,KIF23在JAR细胞、JEG3细胞中呈现高表达,并且KIF23主要集中在3种细胞的胞核。

(3) 相比于对照组,过表达SPOP中KIF23蛋白表达下降,敲低SPOP中KIF23表达升高,加入MG132后被SPOP降解的KIF23表达增多。Flag-SPOP通过免疫共沉淀沉淀KIF23,免疫印迹法中无KIF23对应条带。

(4) KIF23-si RNA1在m RNA水平和蛋白水平都可有效沉默JAR细胞中的KIF23。与NC-si RNA组比,KIF23-si RNA组能明显抑制JAR细胞的增殖能力和侵袭迁移能力;KIF23-si RNA组中总的Akt和总的GSK3β蛋白水平不变,p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β显著降低。

(5) 结合相关实验结果,进一步筛选出DHX9蛋白。

(6)与HTR-8/Svneo细胞相比,DHX9在JAR细胞、JEG3细胞中呈高表达;与SPOP的定位相同,DHX9主要定位于HTR-8/Svneo细胞、JAR细胞和JEG3细胞的胞核中。

参考文献

[1]Intraplacental choriocarcinoma coexisting with fetomaternal hemorrhage:Case report,chemotherapy management,and literature review[J].Qin She;;Zhi Cheng;;Darine El-Chaar;;Feng Luo;;Xiaoyan Guo;;Shi Wu Wen.Medicine,2018(14)

[2]Relative Effects of Age,Race,and Stage on Mortality in Gestational Choriocarcinoma[J].Christopher M.Tarney;;Chunqiao Tian;;Eric R.Craig;;Barbara A.Crothers;;John K.Chan;;Glenn D.Gist;;Nicholas W.Bateman;;Thomas P.Conrads;;Chad A.Hamilton;;George Larry Maxwell;;Kathleen M.Darcy.International Journal of Gynecological Cancer,2018(2)

[3]The Ubiquitin System,Autophagy,and Regulated Protein Degradation[J].Alexander Varshavsky.Annual Review of Biochemistry,2017

[4]Enzyme–substrate relationships in the ubiquitin system:approaches for identifying substrates of ubiquitin ligases[J].Hazel F.O’Connor;;Jon M.Huibregtse.Cellular and Molecular Life Sciences,2017(18)

[5]陈奕余.SPOP通过促进KIF23和DHX9的降解抑制绒毛膜癌的侵袭和迁移能力[D].重庆医科大学,2020.