CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系是1988年从一名患有甲状腺间变性癌的70岁女性的甲状腺（右叶）建立;被描述为在异种移植裸鼠中致瘤。

CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系

CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞培养操作:

1）复苏CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞密度。

2）CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞，根据CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

CAL-62人甲状腺癌贴壁细胞系可以用于甲状腺乳头状癌细胞内cAMP浓度测定及其临床意义

以甲状腺乳头状癌患者手术切除标本为研究材料，在体外对甲状腺癌细胞进行TSH(牛TSH)活化，通过酶联免疫法检测活化后甲状腺乳头状癌细胞中cAMP浓度，同时选取结节性甲状腺肿患者的甲状腺细胞为对照，以评估甲状腺乳头状癌细胞的促甲状腺激素受体活性水平，为甲状腺乳头状癌术后进行内分泌治疗的个体化实施提供参考依据。

方法：共选取2013年1月-2013年6月收治的44例甲状腺乳头状癌患者手术切除的组织标本为观察组研究对象，另选取同时期收治44例结节性甲状腺肿患者手术切除的组织标本为对照组研究对象。

对每一例标本经两位以上病理科医师确认。用ELISA测定试剂盒进行细胞内cAMP测定。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(值)，计算样品浓度，比较两组组织中cAMP浓度。

结果：1甲状腺乳头状癌及结节性甲状腺肿细胞培养形态观察甲状腺乳头状癌细胞在24孔培养板中培养24小时后，开始贴壁，贴壁细胞大部分为圆形、椭圆形或梭形；3-4天后，细胞连接成片或聚集成团，以不规则形为主；5-7天后，细胞逐渐向四周扩展贴壁生长，以单层生长，逐渐铺满培养孔底，此时，细胞为上皮样，多为圆形、椭圆形或梭形，细胞质浓，内有丰富的颗粒物质，细胞核位于细胞一侧，可见核仁。结节性甲状腺肿细胞在24孔培养板中培养24小时后，同样开始贴壁，贴壁细胞大部分为圆形或椭圆形细胞；4-5天后，细胞连接成片；7-10天后，细胞逐渐铺满培养孔底，多为圆形、椭圆形或梭形，细胞质较淡，颗粒物质含量较少，细胞中可见细胞核。

2甲状腺乳头状癌及结节性甲状腺肿细胞cAMP测定比较根据测定结果，绘制标准曲线图，线性方程为Y=0.0036*X-0.0493，R2=0.9665，提示相关性良好。计算的标准曲线方程为X(cAMP浓度)=277.7778*Y+13.6944。根据以上方程计算所得，甲状腺乳头状癌组培养所得细胞cAMP浓度为(64.8337±7.8349)pmol/ml，结节性甲状腺肿组培养所得细胞cAMP浓度为(72.7295±8.6754)pmol/ml，甲状腺乳头状癌组培养所得细胞cAMP浓度低于结节性甲状腺肿组，比较差异有统计学意义(t=4.4804，P=0.0000<0.05)。

结论：1甲状腺乳头状癌细胞cAMP水平低于结节性甲状腺肿细胞，由此推测可能甲状腺乳头状癌细胞促甲状腺激素受体功能低于结节性甲状腺肿细胞。

2. 甲状腺乳头状癌细胞内cAMP浓度在不同个体间存在差异。

3.甲状腺乳头状癌细胞内cAMP浓度测定可做为甲状腺乳头状癌术后个体化内分泌治疗的参考依据。

参考文献

[1]Global variation in the pattern of differentiated thyroid cancer[J].Stacey L.Woodruff;;Olukayode A.Arowolo;;Olusola O.Akute;;Adefemi O.Afolabi;;Fiemu Nwariaku.The American Journal of Surgery,2010(4)

[2]An Increased Incidence of Overt Hypothyroidism after Iodine Fortification of Salt in Denmark:A Prospective Population Study[J]..The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2007(8)

[3]Mouse Thyroid Primary Culture[J].Lukas T.Jeker;;Mehrdad Hejazi;;C.Lynne Burek;;Noel R.Rose;;Patrizio Caturegli.Biochemical and Biophysical Research Communications,1999(2)

[4]HUMAN FETAL PANCREAS–A POTENTIAL SOURCE FOR TRANSPLANTATION[J].D.A.HULLETT;;J.L.FALANY;;R.B.LOVE;;W.J.BURLINGHAM;;M.PAN;;H.W.SOLLINGER.Transplantation,1987(1)

[5]李筱雨.甲状腺乳头状癌细胞内cAMP浓度测定及其临床意义[D].河北医科大学,2014.