重组猴IL-3

背景^[1-5]

Recombinant Rhesus Macaque IL-3（重组猴IL-3）是通过将猴IL-3基因与生物工程菌杂交，之后大量扩陪诱导蛋白表达最后提取纯化出高纯度的重组猴IL-3蛋白。白细胞介素3（IL3）是一种蛋白质，在人中由编码IL3基因。白细胞介素3是一种白细胞介素，一种生物信号（细胞因子），可以改善身体对疾病的自然反应，作为免疫系统的一部分。它通过与白细胞介素-3受体结合起作用。

白细胞介素3刺激多能造血干细胞分化为骨髓祖细胞，或者通过添加IL-7进入淋巴祖细胞。此外，IL-3与其他细胞因子（例如促红细胞生成素（EPO），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF））一起刺激骨髓谱系（粒细胞，单核细胞和树突细胞）中所有细胞的增殖，和IL-6。它由嗜碱性粒细胞和活化的T细胞分泌在免疫反应中支持骨髓中T细胞的生长和分化。

活化的T细胞可诱导其自身的增殖和分化（自分泌信号传导），或其他T细胞（旁分泌信号传导）-均涉及IL-2与T细胞上IL-2受体的结合（在细胞活化时上调，诱导巨噬细胞分泌的IL-1）。人IL-3基因编码长度为152个氨基酸的蛋白质，并且天然存在的IL-3被糖基化。人IL-3基因位于5号染色体上，距离GM-CSF仅9千碱基基因，其功能与GM-CSF非常相似。

研究应用^[6][7]

1.对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响

方法：将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组(无细胞因子组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3(C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组+白细胞介素3(D组)。

主要观察指标:在0,7d检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数。结果:与对照组相比,A,B,C,D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P<0.05),C,D两组扩增效果均优于A,B组,差异显著(P<0.05),但A,B两组之间无明显区别(P>0.05),D组能有效的扩增脐血细胞,并优于C组(P<0.05)。

A,B,C,D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d,CD62L和趋化因子受体4的表达,A,B两组之间差异不显著(P>0.05),但均优于C组(P<0.05),D组CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A,B,C组(P<0.05)。结论:白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞,并能促进和归巢有关的CD49d,CD62L及趋化因子受体4表达。

2.用于靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究

方法用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3/IL3,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3*/IL3,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。

用同样的方法表达抗CD3*/m2IL3、抗CD3／m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测抗CD3*/m2IL3.抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白与CD123+M07e细胞和CD3+Jurkat细胞的结合活性,将4种融合蛋白在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。

利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL)作为效应细胞,首先以TF1细胞或M07e或AML病人干细胞(CD34+CD38-CD123+为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3/抗CD19双功能抗体为对照,另设CD123一的k562细胞为非相关靶细胞组,比较融合蛋白介导的特异性体外杀伤活性。

取上述杀伤实验效靶比25：1,融合蛋白浓度500ng/ml各组,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放。结果基因重组质粒pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3.pAYZ CD3*/m2IL3.pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3经测序证实序列正确,构建成功。抗CD3*/IL3在原核表达系统中进行可溶性表达过程中发现,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后,12%SDS-PAGE显示在27kD,30KD和57kD各有一条带,但western-blot显示在30KD和57kD均有带。

参考文献

[1] Yang YC,Ciarletta AB,Temple PA,Chung MP,Kovacic S,Witek-Giannotti JS,Leary AC,Kriz R,Donahue RE,Wong GG(October 1986)."Human IL-3(multi-CSF):identification by expression cloning of a novel hematopoietic growth factor related to murine IL-3".Cell.47(1):3–10.

[2] Ihle JN,Pepersack L,Rebar L(June 1981)."Regulation of T cell differentiation:in vitro induction of 20 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase in splenic lymphocytes from athymic mice by a unique lymphokine".J.Immunol.126(6):2184–9.PMID 6971890.

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[6] 靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究[D].张秀丽.北京协和医学院.2011

[7] 白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响[J].许力,毛平.中国组织工程研究与临床康复.2009(01)