急性髓系细胞白血病细胞的应用

背景^[1-3]

急性髓系细胞白血病细胞由H.P.Koeffler和D.W.Golde建立。骨髓抽自一个59岁的患有红白血病而后又发展成急性骨髓原性白血病的男性白人。KG1细胞在形态上类似急性髓原白血病，表现为明显的多形化，骨髓母细胞和骨髓细胞占优势。少量细胞是成熟的粒细胞，也有微量的巨噬细胞和嗜曙红细胞。

急性髓系细胞白血病细胞

急性髓系细胞白血病细胞培养操作规程：

一．急性髓系细胞白血病细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）急性髓系细胞白血病细胞完全培养基：IMDM+20%FBS++1%双抗

2）急性髓系细胞白血病细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%

3）急性髓系细胞白血病细胞冻存液：70%IMDM，20%血清，10%DMSO，现用现配。

二．急性髓系细胞白血病细胞处理：

1）复苏急性髓系细胞白血病细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入5mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入培养瓶中培养。

2）急性髓系细胞白血病细胞传代：当细胞密度达到1X106/mL时即进行传代培养

1.将培养瓶中细胞轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液。

2.按照2-4X105/mL细胞量密度用新鲜培养基重悬细胞，按照上述推荐接种密度将5mL新鲜培养液移入到T-25培养瓶中或15mL新鲜培养液移入到T-75培养瓶中培养。

3.每间隔2-3天对细胞进行换液或传代培养。

3）急性髓系细胞白血病细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞直接计数后离心，用70%IMDM+20%FBS+10%DMSO冻存液重悬细胞沉淀，按每1ml的数量分配到冻存管中

应用^[4][5]

急性髓系细胞白血病细胞可以用于基于RNA-Seq技术探讨三氧化二砷对人急性髓系白血病细胞（KG-1a）基因表达的影响

研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对急性髓系白血病KG-1a细胞增殖,周期和凋亡的影响,并且利用RNA-Seq技术筛选与三氧化二砷作用密切相关的应答基因,为阐明三氧化二砷的作用机制提供实验证据。

方法1.采用CCK-8法检测ATO对KG-1a细胞增殖的影响。

2. 采用流式细胞术检测ATO对KG-1a细胞凋亡的影响。

3. 采用流式细胞术检测ATO对KG-1a细胞周期的影响。

4. 采用RNA-Seq技术获取ATO 2μmol/L组和control组的差异基因(DEGs)。

5. 采用GO及KEGG进行生物功能富集分析。

6. 利用String、Cytoscape构建DEGs的蛋白互作网络并筛选Hub gene;

7. 采用荧光定量PCR技术验证m RNA水平表达情况；

8. 采用蛋白印迹技术验证蛋白水平表达情况。

结果：1.CCK-8结果显示ATO浓度在3μmol/L以下,不同浓度组间抑制率差异具有统计学意义(P值均<0.05)。

2. 流式细胞术检测凋亡的结果显示,当ATO浓度在1.5μmol/L-3μmol/L之间,加药组细胞的凋亡率和对照组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。

3. 流式细胞术检测细胞周期的结果表明,周期分布的变化主要集中在G2/M期。随着ATO浓度的增加,G2/M期细胞所占比例呈现上升趋势,和对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

4. 经RNA-Seq分析,筛选到的差异基因共有5371个,上调的有2666个,下调的有2705个。

5. GO富集结果显示,上调的差异基因主要参与以下生物学过程:对未折叠蛋白的反应和对拓扑错误蛋白的反应,粒细胞活化以及介导的免疫反应,解毒过程,自噬以及自噬的调节等过程;下调的差异基因富集到的生物学过程条目主要涉及核糖核酸蛋白复合体生物发生,DNA复制,DNA生物合成,甲基化,细胞周期G1/S相转变,通过端粒酶进行端粒维护等过程。

6. KEGG富集的结果显示,上调的差异基因主要参与以下信号通路:吞噬体,细胞色素P450对外来物质的代谢作用,溶酶体,过氧化物酶体,谷胱甘肽代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,矿物质吸收,自噬,化学致癌作用,PPAR通路等相关信号通路;下调的差异基因主要参与真核生物中的核糖体生成,嘌呤及嘧啶代谢,RNA转运,细胞周期,剪接体,人T细胞白血病病毒Ⅰ型感染,DNA复制,RNA聚合酶,TGF-β通路等相关通路。

7. PPI互作网络结果显示,核心网络节点基因有MYC、MCM7和PCNA。

8. 荧光定量PCR结果表明,在KG-1a细胞和其他三种AML细胞株中,差异基因(MYC、MCM7、PCNA、BCL2L1、CCNE1、BAX、BAD、CDKN1A、CDKN1C和CDKN3)m RNA的表达水平和RNA-seq的结果具有一致性。

9.蛋白印迹实验结果表明,在KG-1a细胞和其他三种AML细胞株中,MYC、MCM7、PCNA、BCL2L1、BAX、BAD、P21和P57蛋白的表达水平和RNA-seq的结果具有一致性。

参考文献

[1]Acute Myeloid Leukemia:A Review.[J].Pelcovits Ari;Niroula Rabin.Rhode Island medical journal(2013),2020(3)

[2]Neurotoxic Mechanism of Arsenic:Synergistic Effect of Mitochondrial Instability,Oxidative Stress,and Hormonal-Neurotransmitter Impairment.[J].Medda Nandita;Patra Ritesh;Ghosh Tamal K;Maiti Smarajit.Biological trace element research,2020(1)

[3]Inhibition of PI3K pathway using BKM120 intensified the chemo-sensitivity of breast cancer cells to arsenic trioxide(ATO)[J].Faranak Alipour;;Niknam Riyahi;;Ava Safaroghli-Azar;;Soyar Sari;;Zahra Zandi;;Davood Bashash.International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2019

[4]Synergy between arsenic trioxide and JQ1 on autophagy in pancreatic cancer.[J].Xu Congling;;Wang Xinrui;;Zhou Yu;;Chen Fei Xavier;;Wang Haiwei;;Li Kening;;Fan Huiyong;;Tang Xiaomei;;Jiang Guojuan;;Zhang Ji.Oncogene,2019(47)

[5]李雅慧.基于RNA-Seq技术探讨三氧化二砷对人急性髓系白血病细胞（KG-1a）基因表达的影响[D].新乡医学院,2021.