鸟苷抑制HCV复制并增加Indel频率，这与胞内核苷酸池的改变有关

发布日期:2023/5/4 10:21:49

摘要：在研究霉酚酸和利巴韦林抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的机制过程中，作者观察到鸟苷(Gua)对HCV的抑制作用。在本文，研究人员发现四种核苷中，仅GUA抑制HCV在人肝癌细胞中的复制。GUA并不直接抑制NS5B的聚合酶活性，但改变了胞内核苷二磷酸(NDPs)和三磷酸(NTPS)的水平，导致HCV RNA复制不足，减少了传染性子代病毒的产生。NTPs或NDPs浓度的变化改变了NS5B RNA聚合酶的体外活性，影响从头合成RNA和模板切换。此外，GUA介导的这种变化与病毒RNA中INDELs数量的显著增加有关，这可能是病毒后代特异性感染性降低的原因，表明存在有缺陷的病毒基因组。因此，适当的NTP：NDP平衡对于确保HCV聚合酶的保真度和程度减少基因组缺陷的产生至关重要。

全文地址：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010210

简要内容：

1.核糖核苷对HCV复制的影响

HCV在GUA处理的Huh-7.5细胞上传代，其传染性持续下降(图1A和1B)，但在ADE、Cyt或URI存在的情况下，病毒可以持续复制(图1C和1D)。因此，GUA是唯一具有抗病毒活性且无细胞毒性的核苷。由于病毒对细胞的适应性可能影响病毒对抗病毒药物的应答，作者将HCV在Huh-7.5细胞上传代100次，以研究高适合性的HCV对Gua的反应，结果表明，丙型肝炎病毒P100对Gua的耐药性增加。

Fig1.核糖核苷对HCV复制的影响

2.鸟苷对丙型肝炎病毒NS5B活性的影响

为分析GUA抑制HCV复制的机制，作者体外测试了GUA浓度增加对HCV聚合酶活性的影响。当GUA浓度达到500μM时，NS5B聚合酶活性增加，即使在1mM的GUA浓度下，NS5B聚合酶活性也与无GUA处理时相近。只有在非常高的GUA浓度(10 MM)时，RNA聚合酶活性才显着降低(图4A)。使用19-mer寡核苷酸LE19(图4B)也得到了类似的结果。因此，GUA对HCV产生的抑制不能归因于其对RNA聚合酶的直接抑制。

Fig4. 鸟苷对丙型肝炎病毒NS5B活性的影响

3.鸟苷对细胞内核苷酸池的影响

为探讨该抑制作用是否与胞内核糖核苷二磷酸/三磷酸的变化有关，作者测定了ADE、Cyt、GUA或URI作用72h后，HUH-7.5细胞中NTP和NDP的水平，都引起了核苷二磷酸/三磷酸浓度的增加(图5)。然而，只有URI和GUA分别诱导了UTP和GTP的增加，其中GUA引起的变化最为显著(图5A)，细胞内NDP浓度如图5B所示。

Fig5.鸟苷对细胞内核苷酸池的影响

4.核苷二磷酸/三磷酸失衡对体外 HCV NS5B活性的影响

为探索核苷酸浓度的变化是否会影响病毒聚合酶的活性，作者使用重组NS5BΔ21在NTP或NDP浓度增加的情况下的进行了体外RNA聚合实验。在相应的核苷三磷酸浓度增加的情况下，测量了从头合成(DN)、引物延伸(PE)和模板切换(TS)聚合酶的活性(图8)。1 mM的高UTP浓度轻微但显著地降低了引物延伸活性(图8A)。然而，NTP浓度的主要影响RNA的从头合成，其在高ATP浓度下显著下降(图8B)，在高GTP浓度下显著增加(图8C)。从头RNA合成的增强伴随着模板切换的增加(图8C)。

由于增加GUA浓度会改变细胞内NDP浓度(图5)，作者研究了增加NDP浓度是否影响NS5B RNA聚合酶的体外活性。在固定的核苷三磷酸浓度下，增加相应的核苷二磷酸浓度，并测量了DN、PE、TS的活性(图9)。NDP的主要影响RNA从头合成，其在高浓度的ADP和GDP情况下显著减弱。在引物延伸和模板切换方面则没有统计学差异(图9)。

Fig8. 核苷三磷酸的浓度对NS5B RNA聚合酶活性的影响