重组小鼠GMF-β

背景^[1-4]

Recombinant Murine GMF-β(重组小鼠GMF-β)胶质细胞成熟因子是涉及神经系统发育，血管生成和免疫功能的神经营养因子。通过晶体学和核磁共振解析的小鼠胶质细胞成熟因子β和γ的结构揭示了与ADF-H（肌动蛋白解聚因子同源性）结构域的相似性和关键差异，并提出了实验性解决该蛋白质家族功能的新方法。NGF-β具有神经生长刺激活性，并且该复合物参与调节生长和交感神经和某些感觉神经元的分化。

该基因的突变与遗传性感觉和自主神经病变，5型（HSAN5）有关，该基因表达的失调与过敏性鼻炎有关神经生长因子是从神经营养因子家族中发现的种蛋白质，它影响交感神经和感觉神经元的生长和分化。NGF由3种不同的亚基组成：α，β和γ。β亚基对其生长刺激活动负责。

星形胶质细胞中NGF的合成通过一系列细胞因子如IL1，TNF-α，PDGF和TGF-b而增强。在大肠杆菌中产生的重组小鼠b-NGF是非共价二硫键连接的同型二聚体，非糖基化的多肽链，其含有2个相同的链，每个链120个氨基酸，每个链的分子量为13,471道尔顿。重组小鼠GMF-β是通过将小鼠GMF-β基因与生物工程菌杂交，之后大量扩陪诱导蛋白表达最后提取纯化出高纯度的重组小鼠GMF-β蛋白

 研究应用^[5][6]

1.神经胶质成熟因子beta(GMFβ)在小鼠脑积水病理条件下的表达分析

通过基因芯片技术初步检测野生型正常小鼠、AQP4敲除正常小鼠和AQP4敲除自发脑积水小鼠的大脑组织中基因群的表达差异,筛选出可能相关基因,为进一步深入研究脑积水病理过程提供新线索。其中神经胶质成熟因子beta(GMFβ)的mRNA水平在脑积水病理条件下比正常情况下调最为明显,预示其可能是一种参与脑积水病理过程相关的蛋白因子,需要进一步深入研究。

应用RT-PCR技术,从成年CD1小鼠大脑总RNA中获得GMFβ基因编码区全长DNA序列,将此序列克隆入GST融合蛋白原核表达载体pGEX-2T,成功构建重组表达质粒pGEX-2T-GMFβ;转化大肠杆菌E.coli.BL21/DE3,用IPTG大量诱导GST融合蛋白表达,优化表达和提取条件以提高上清可溶性蛋白含量,使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和纯化,免疫兔子得到多克隆抗血清,经ELISA和免疫组化鉴定抗体的效价和特异性较好;进行RT-PCR和免疫印迹检测,半定量分析脑积水小鼠(AQP4-/-,spontaneous hydrocephalus)大脑组织的GMFβ表达比正常小鼠(wt.nor.和AQP4-/-nor.)减少,与基因芯片检测结果基本一致。

2.用于研究GMF-β与MEK信号通路cross-talk介导榄香烯的抗胶质瘤作用

方法以不同浓度榄香烯作用于人U87MG胶质瘤细胞,噻唑蓝(Methyl Thiazolyl Tet-razolium,MTT)法检测细胞活性。免疫沉淀联合Western blot法检测经榄香烯处理的U87MG细胞中总GMF-β及磷酸化GMF-β(p-GMF-β)蛋白的表达水平。通过RNA干扰技术使GMF-β的表达沉默,然后以MTT法检测榄香烯的抗胶质瘤增殖能力。

Western blot法检测榄香烯对丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6(Mitogen-activated Protein Ki-nase Kinase 3/6,MEK3/6)的激活作用是否因GMF-β的沉默而受到影响。结果榄香烯显著抑制了人U87MG细胞的增殖,并可使GMF-β、MEK3和MEK6的磷酸化水平上调。沉默GMF-β的表达导致MEK3和MEK6的磷酸化水平下调,榄香烯的抗胶质瘤细胞增殖作用减弱。结论GMF-β与MEK信号通路的交互作用(cross-talk)介导了榄香烯的抗人胶质瘤细胞增殖作用。

参考文献

[1] Protein Summary".Retrieved 2008-10-31.

[2] 韩锋.miR-124靶作用GMFβ基因调节卵巢癌细胞的侵袭和转移[D].中国医科大学,2017.

[3] GMFβ-MKK3/6信号通路在β-榄香烯抗脑胶质瘤细胞增殖中的作用[D].朱廷准.大连医科大学.2011

[4] 神经胶质成熟因子beta(GMFβ)在小鼠脑积水病理条件下的表达分析[D].石健.东北师范大学.2009

[5] MEK信号通路活化在榄香烯致人源U87MG胶质瘤细胞增殖抑制及G0/G1细胞周期阻滞中的作用[J].朱廷准,徐英辉,李晓明,罗力涵,梁国标.实用药物与临床.2013(01)294

[6] GMF-β与MEK信号通路cross-talk介导榄香烯的抗胶质瘤作用[J].朱廷准,徐英辉,李晓明,罗力涵,梁国标.实用药物与临床.2013(03)