人神经母细胞瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人神经母细胞瘤细胞由J.L.Bieder建系，它与SK-N-MC所不同的是倍增时间较长且多巴胺-β-羟基酶水平较高。SK-N-SH在细胞介导的细胞毒性试验中用作靶细胞系。

人神经母细胞瘤细胞培养步骤：

一．人神经母细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM及F-12培养基(MEM:GIBCO,货号11095-080)，45%；F-12(F-12：GIBCO,货号11765-054)，45%；优质胎牛血清，10%。

2）人神经母细胞瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

人神经母细胞瘤细胞

二．人神经母细胞瘤细胞细胞处理：

1）复苏人神经母细胞瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人神经母细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人神经母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人神经母细胞瘤细胞可以用于盐酸去氢骆驼蓬碱对人神经母细胞瘤细胞的抑制作用及其机制初探

基于网络药理学与分子对接技术,初步探讨盐酸去氢骆驼蓬碱(Harmine Hydrochloride,HMH)抑制人神经母细胞瘤(Nueroblastoma,NB)的可能作用靶点,并运用细胞及分子生物学手段验证HMH对SH-SY5Y细胞的抑制作用及其作用机制。

方法:(1)采用网络药理学方法预测HMH作用于NB的可能作用靶点,再利用DAVID数据库对潜在靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析;

(2) 利用分子对接技术对HMH与可能的核心靶点进行对接分析;

(3) 通过MTT法及克隆形成实验检测不同浓度HMH对SH-SY5Y细胞存活率的影响;

(4) 采用Hoechst/PI染色法观察不同浓度HMH对SH-SY5Y细胞形态变化的影响;

(5) 利用Western blot法检测不同浓度HMH对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62表达的影响;

(6) 采用Western blot法检测同时给予HMH和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)时对LC3-Ⅱ、P62蛋白表达的影响及细胞形态的改变;

(7) 利用Western blot法检测HMH对Akt、m TOR蛋白磷酸化水平的影响;

(8) 利用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的水平;

结果:网络药理学与分子对接实验结果显示:

(1)共获得HMH治疗NB的36个潜在靶点,GO富集分析获得155个相关过程,KEGG通路分析获得63条信号通路;

(2) 通过拓扑分析共获得CASP3、MAPK1、MMP2等14个核心靶点,HMH与各核心靶蛋白均能较好的结合。

体外实验结果显示,给予HMH干预24 h后,随着HMH浓度的增加:(1)SH-SY5Y细胞存活率下降,克隆的数量和大小明显减少(P<0.05);

SH-SY5Y细胞形态发生显著的凋亡样变化(P<0.05);

（3）同时,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3的比值显著增加,与自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达量明显增加,而P62的表达量显著减少(P<0.05);

（4）HMH浓度为40μmol·L-1时,HMH与3-MA联合应用组,与单独HMH处理组相比LC3-Ⅱ的表达量降低(P<0.05),细胞存活率明显降低;

（5）HMH浓度为40μmol·L-1时,与对照组相比,Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平降低(P<0.05);

（6）给药24 h后,随着HMH浓度的增加,细胞内ROS水平也显著升高(P<0.05)。

结论:HMH可能通过抑制Akt/m TOR通路发挥抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的作用,诱导凋亡与应激保护性自噬,另外HMH促进ROS释放来发挥对人神经母细胞瘤的抑制作用。HMH有望开发成为抑制人神经母细胞瘤的候选药物,但是HMH对细胞迁移、侵袭,细胞周期及细胞血管形成的影响有待进一步深入研究。

参考文献

[1]The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism.[J].Hoxhaj Gerta;;Manning Brendan D.Nature reviews.Cancer,2020(2)

[2]Natural alkaloid harmine promotes degradation of alpha-synuclein via PKA-mediated ubiquitin-proteasome system activation[J].Cui-Zan Cai;;He-Feng Zhou;;Ning-Ning Yuan;;Ming-Yue Wu;;Simon Ming-Yuen Lee;;Jiao-Yan Ren;;Huan-Xing Su;;Jin-Jian Lu;;Xiu-Ping Chen;;Min Li;;Jie-Qiong Tan;;Jia-Hong Lu.Phytomedicine,2019

[3]Harmine induces anticancer activity in breast cancer cells via targeting TAZ.[J].Ding Yu;;He Jinrong;;Huang Juan;;Yu Tong;;Shi Xiaoyan;;Zhang Tianzhu;;Yan Ge;;Chen Shanshan;;Peng Caixia.International journal of oncology,2019(6)

[4]Harmine mitigates LPS-induced acute kidney injury through inhibition of the TLR4-NF-κB/NLRP3 inflammasome signalling pathway in mice[J].Xiaofeng Niu;;Qing Yao;;Weifeng Li;;Lulu Zang;;Wenqi Li;;Jinmeng Zhao;;Fang Liu;;Wenbing Zhi.European Journal of Pharmacology,2019

[5]西仁阿依·西热甫.盐酸去氢骆驼蓬碱对人神经母细胞瘤细胞的抑制作用及其机制初探[D].新疆医科大学,2021.