人乳腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人乳腺癌细胞是从一名69岁白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立，常用于乳腺癌发病机理的研究。

人乳腺癌细胞

人乳腺癌细胞属于贴壁细胞，显微镜下呈现上皮细胞形态，且保留了多个分化乳腺上皮的特性，

包括：1）能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构（domes）；

2）能表达WNT7B癌基因；

3）肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞生长；

4）细胞经抗雌激素处理能调节胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的分泌。

人乳腺癌细胞培养步骤：

1）复苏人乳腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）人乳腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁人乳腺癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3、人乳腺癌细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃。

应用^[4][5]

人乳腺癌细胞可以用于姜黄素通过自噬-CTSB-炎症小体信号通路诱导人乳腺癌细胞（MCF-7）焦亡的研究

姜黄素作为一种降血脂药物,其潜在的独特的抗癌特性一直被广泛关注。探讨姜黄素对MCF-7乳腺癌细胞的影响以及其潜在的体内外分子机制。

方法:体内实验:建立乳腺癌动物模型,观察姜黄素对肿瘤生长的影响,免疫组化法检测Caspase-1、IL-1β和IL-18的阳性反应情况。Western blot法测定肿瘤组织中焦亡相关蛋白ASC、pro-Caspase-1、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18;NLRP3炎症小体;组织蛋白酶B;自噬相关蛋白LC3及p62的表达水平。

体外实验:MTT法测定姜黄素对细胞存活率的影响。Western blot法测定焦亡相关蛋白ASC、pro-Caspase-1、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18;NLRP3炎症小体;组织蛋白酶B;自噬相关蛋白LC3及p62的表达水平。ELISA与LDH法检测细胞外的IL-1β、IL-18和LDH的释放量。免疫荧光法测定胞质CTSB的表达水平以及细胞溶酶体的破坏情况。Transwell细胞迁移实验、微血管形成实验、平板克隆实验用于测定姜黄素对细胞功能的影响。

本研究使用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950、组织蛋白酶B抑制剂CA-074 Me、自噬抑制剂3-MA作用于细胞,探讨NLRP3炎症小体、组织蛋白酶B和细胞自噬在姜黄素诱导MCF-7乳腺癌细胞焦亡中的作用。

结果:姜黄素能够显著降低MCF-7乳腺癌细胞存活率。MTT法筛选出药物处理条件为姜黄素8μM处理48小时。姜黄素能够在体内外诱导MCF-7乳腺癌细胞发生焦亡:姜黄素处理组小鼠肿瘤组织切片焦亡相关蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫组化阳性反应显著。

姜黄素处理组相比于对照组LC3、CTSB、ASC、proCaspase-1、GSDMD、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达水平显著升高,p62蛋白表达水平显著降低;姜黄素处理组的IL-1β和IL-18以及LDH释放量相比于对照组显著升高;姜黄素处理组相比于对照组能够显著降低MCF-7乳腺癌细胞的细胞迁移、微血管形成和平板克隆能力。

姜黄素诱导MCF-7细胞焦亡是基于NLRP3炎症小体的激活:经MCC950预处理4小时后,对照组NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达水平、IL-1β和IL-18以及LDH释放量相比于姜黄素处理组显著降低。细胞迁移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黄素处理组显著升高。

姜黄素诱导NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡是由胞质CTSB介导的:经CA-074 Me预处理4小时后,对照组CTSB、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平、胞质CTSB水平、IL-1β和IL-18以及LDH的释放量相比于姜黄素处理组显著降低;细胞迁移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黄素处理组显著升高。

姜黄素使MCF-7细胞自噬水平上调并通过自噬诱导CTSB释放、NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡:经3-MA预处理4小时后,对照组LC3、CTSB、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表达水平、IL-1β和IL-18以及LDH的释放量相比于姜黄素处理组显著降低;p62蛋白表达水平、细胞迁移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黄素处理组显著升高。

结论:姜黄素能够诱导MCF-7乳腺癌细胞自噬进一步激活NLRP3炎症小体,通过自噬/CTSB/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导细胞焦亡,并能够抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖和迁移。

参考文献

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[5]段昊楠.姜黄素通过自噬-CTSB-炎症小体信号通路诱导人乳腺癌细胞（MCF-7）焦亡的研究[D].大连医科大学,2021.