适体修饰热启动酶的热启动改造与修饰

背景^[1]

适体修饰热启动酶(Hotstart Taq DNA Polymerase)是一种适体基团修饰的耐热性Taq DNA聚合酶,高温加热前,适体修饰基团与Taq酶结合,抑制聚合酶的活性,避免了引物延伸的非特异性扩增或引物二聚体的产生,增强了DNA扩增的特异性,灵敏度和稳定性,广泛适用于常规PCR,多重PCR及巢式PCR等。经过95°C热激10 min后,该酶即可恢复活性。

适体修饰热启动酶没有检测到3′→5′校对外切酶活性,但具有5′→3′外切酶活性,可用于荧光定量PCR的检测。Hotstart Taq DNA Polymerase在常温下没有活性,便于PCR实验的常温操作。

提高适体修饰热启动酶耐热性^[2]

Stofell片段是 Taq DNA聚合酶通过缺失突变去除N端第1－289个氨基酸而得到的。实验证明，全长 Taq DNA聚合酶在97．5℃加热9min还可以保持一半以上的活性，而 Stofell 7在97．5℃则可以持续21min保持一半以上的活性Klentaq也是一种 Taq DNA聚合酶的突变体，它也比 Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性。在应用方面，去掉N端5－3外切酶活性以后的大片段 Taq DNA聚合酶的耐热性提高，变性温度可达到98℃，更适合扩增GC含量高和二级结构强的模板，结合其所具有的3－5外切校正功能，使其具备了扩增长链DNA的能力，可以扩增35kb以上的模板。除此之外，去除大片段 Taq DNA聚合酶表面的10个不稳定的氨基酸，并且加入两个硫水氨基酸后，酶的活性和热稳定性都会有所提高。

热启动改造与修饰^[3]

Taq DNA聚合酶在75℃－80℃时活性最高，但是在温度较低时，该聚合酶的活性也依然存在。这就使得在PCR反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，很容易出现引物互搭或引物与模板中的一些非靶位点错配的现象，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，形成引物二聚体和非特异性产物。这些引物二聚体和非特异性产物又可作为引物或模板在以后的PCR循环中继续扩增，使非特异产物不断扩增和累积。如果PCR的循环数较多、扩增子的GC含量较高以及多重PCR体系，也很容易产生引物二聚体和非特异性产物，既降低了目的产物的扩增效率，又影响PCR在检测及测序等方面的应用。

方法有：基因突变、化学修饰、抗体修饰法、核酸适配体修饰。

参考文献

[1] 适体修饰热启动酶产品介绍

[2] Taq DNA 聚合酶的结构修饰与表征.郭佳

[3] Poddar S, Sawyer M, Conor J. Effect of inhibitors in clinical specimens on Taq and Tth DNA polymerase-based PCR amplification of A virus .Journal of Medical Microbiology.