碱性磷酸酶试剂盒的使用方法

概述

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)在碱性环境中可催化水解磷酸酯。碱性磷酸酶的表达水平和活性变化与肝脏和骨骼的很多病理状态有关。联科生物的碱性磷酸酶活性检测试剂盒以 4-硝基苯磷酸盐(pNPP) 为底物，可方便、快捷、灵敏地检测哺乳动物的血清及其它生物样品中的碱性磷酸酶活性。

组分

使用方法

1. 试剂准备：取出所有试剂(包括检测样品)，恢复至室温。 标准品工作液：取 15 μl p-nitrophenol 溶液(10 mM)，用检测缓冲液稀释至 0.3 ml，最终浓度为 0.5 mM。

2. 检测方案参考如下。标准品的用量分别为 2、4、8、16、24、32 和 40 μl，推荐设两个重复。样品通常 加 50 μl，如样品中的碱性磷酸酶活性过高，可减少样品用量或适当稀释后。为消除有色样本本身颜色 的影响，需设立样品对照孔，即加入样本，以检测缓冲液代替显色底物的对照。

3. 加完所有样品后，在微孔板震荡器上震荡混匀数十秒。37℃避光孵育 5 - 10 分钟。若待测样品中碱性 磷酸酶活性较低，可适当延长孵育时间至 30 分钟。

4. 每孔加入100 μl终止液终止反应。

5. 在405 nm或400 - 415 nm范围内检测吸光度。如不能立即测定，可在数小时内完成测定，所显现的黄色 在数小时内稳定。

6. 结果计算：将标准品孔的OD值减去空白对照孔的OD值，校准后的标准品孔OD值与对应的p-nitrophenol 浓度建立标准曲线。样品孔的OD值减去样品对照孔的OD值，校准后的样品OD值代入标准曲线，计算 p-nitrophenol浓度。 碱性磷酸酶活性(U/ml) = A/V/T。其中A为样品中产生的p-nitrophenol量(μmol)；V为样品体积(ml)；T为 反应时间(min)。

7. 碱性磷酸酶活性单位的定义：在 pH9.8 的 DEA 缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解 pNPP 显色底物产 生 1 μmol p-nitrophenol 所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个 DEA酶活力单位。在 pH9.6 的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解 pNPP 显色底物产生 1 μmol p-nitrophenol 所需 的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个 Glycine 酶活力单位。一个 Glycine 酶活力单 位约相当于 3 个 DEA 酶活力单位。本试剂盒测定的是 DEA 酶活力单位。

注意事项

1. 请在使用本产品前仔细阅读说明书。本产品仅用于科研，不可用于诊断。

2. 为了您的安全和健康，请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。

3. 样品中不能含有磷酸酶抑制剂，如EDTA、草酸盐、氟化物和柠檬酸盐等。

4. 所有样品避免反复冻融，建议分装后冻存。

5. 血清样品通常需10倍稀释，其它样品可做梯度稀释，使OD值落于标准曲线检测范围内。可用原裂解 液 或PBS或本试剂盒提供的检测缓冲液进行稀释。

参考文献

磷酸酶活性分析试剂盒产品介绍