人成巨核细胞白血病细胞的应用

背景^[1-3]

人成巨核细胞白血病细胞源自一位CML患者成巨核细胞转换期的骨髓细胞。细胞质因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反应，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶阳性。髓过氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和碱性磷酸酶阴性。用单克隆抗体BA-1(抗B细胞，粒性白细胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗单核细胞，血小板)染色成阳性。其他淋巴和骨髓类抗体成阴性。

人成巨核细胞白血病细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人成巨核细胞白血病细胞可以用于自噬紊乱对巨核细胞发育的影响和机制的研究

探究自噬紊乱对巨核细胞发育可能造成的影响,影响的具体阶段以及发生机制。

方法主要通过利用体外自噬流调节药物雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)和体内巨核细胞-血小板上自噬基因Atg7特异性敲除小鼠模型(Atg7flox/flox PF4-Cre)分别造成不同发育阶段的巨核细胞的自噬紊乱和自噬缺失研究自噬对巨核细胞发育的影响。

1. 体外研究：首先在造血干细胞和成熟的巨核细胞阶段加入雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)成功调节早期和晚期巨核细胞内自噬的水平,通过western blot检测经典的自噬小体标记物LC3-Ⅱ的蛋白表达予以确认。然后,结合巨核细胞发育前、后期不同的特点依次检测发育前期巨核细胞的细胞核、细胞质成熟,代表分化程度的膜蛋白CD41与CD61的表达,前血小板的形成,血小板的释放和发育后期巨核细胞产生前血小板的能力。

2. 体内研究：检测正常生理情况下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠与其同窝对照小鼠Atg7flox/flox的血小板数目,巨核细胞的成熟,以及在低剂量X射线辐照诱导条件下,小鼠获得暂时性血小板减少症之后的血小板恢复情况。

3.机制初步探讨：运用western blot及Q-PCR的方法检测调控巨核细胞发育相关的分子表达,解释自噬调控巨核细胞发育的可能机制。结果我们在原代分离的小鼠胎肝细胞培养基中加入雷帕霉素(Rap)诱导自噬或巴弗洛霉素(BafA)阻断自噬,我们发现与溶剂对照组(DMSO)相比自噬被调节的两组产生的多倍体巨核细胞数量明显减少(Rap 54.8±0.6%,BafA 50.4±3.8%,Ctrl 71.1±2.0%,P＜0.05),同时代表巨核系分化的膜蛋白CD41和CD61表达(Rap1.0±0.1%,BafA 0.7±0.0%,Ctrl 5.2±0.1%,P<0.001)及血小板释放(Rap 0.4±0.3%,BafA 0.7±0.1%,Ctrl 8.5±0.5%,P<0.05)均显著性降低即用雷帕霉素(Rap)或巴弗洛霉素(BafA)调节造血干细胞的自噬能抑制巨核细胞的细胞核的成熟及巨核系的分化。

参考文献

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