小鼠胚胎成纤维细胞培养

小鼠胚胎成纤维细胞简介^[1-3]

小鼠胚胎成纤维细胞作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF的缺点是无法耐受G418的筛选。替代方法是从持续表达抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF。利用各种转基因鼠培养的MEF细胞还是各种基因功能研究的良好工具。

小鼠胚胎成纤维细胞

（一）材料

12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠／次），培养皿（直径10cm),DMEM+10%新生牛血清，15cm或50cm离心管（圆底），PBS配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。

（二）操作步骤

1.一般操作

(1)在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks溶液消洗。

(2)除掉四肢、大脑及内脏（肝脏）。

(3)用无菌Hanks溶液＋PBS漂洗3次。

(4)置培养皿中，用手术剪切碎。

(5)将剪碎组织移入50ml离心管中，加入约10ml消化液。

(6)37°C摇育10min（置水浴或孵育箱中）。

(7)吸5ml上清液放入另一50ml离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM培养液中和胰蛋白酶。

(8)再加入4ml消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min后再吸出5ml上清液到另一离心管中，加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。

(9)重复上一步骤5次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。

(10)离心50ml离心管，加50ml含10％新生牛血清的DMEM培养液。

(11)取适量移到培养皿或培养瓶中培养。

(12)第二天换液，直到细胞长满（汇合），1:10传代，再生长至合适密度时可进行冻存。

(13)根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。

2.丝裂霉素处理或γ-射线处理用作饲养层的MEF细胞还须进行丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。

（1）丝裂霉素处理

复苏冻存的MEF细胞(5×104个/cm2，保证用时满满一层，不留空间。

汇合状态下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml丝裂霉紊的DMEM培养液，37°C、5%CO2培养箱中培养2~3h。

以PBS彻底漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×105g个/ml。

将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理：0.1％明胶溶液浸泡2h,移走多余的明胶，待自然干燥。）

(2)γ-射线处理

汇合状态的MEF细胞，以30~100Gy的γ－射线处理。

胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000转，10min)、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个／ml的浓度冻存起来。复苏后，1支冻存管可接种到4~5块直径6cm的培养皿中。

小鼠胚胎成纤维细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

参考文献

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