人宫颈癌细胞的应用

背景^[1-3]

人宫颈癌细胞是个来自人体组织经连续培养获得的非整倍体上皮样细胞系，它由Gey GO等在1951年从31岁女性黑人的宫颈癌组织建立。经原始组织切片重新观察，Jones等将其诊断为腺癌。已知该细胞系含有人乳头状瘤病毒HPV18序列，需在2级生物安全防护台操作。该细胞角蛋白阳性，p53表达量较低，但表达正常水平的pRB（视网膜母细胞瘤抑制因子）。

人宫颈癌细胞

人宫颈癌细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议T25培养瓶1：2传代。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM（推荐iCell-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人宫颈癌细胞可以用于淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究

对淫羊藿素抑制宫颈腺癌细胞株HeLa和鳞状上皮细胞癌细胞株SiHa的效果以及ROS在其抗癌活性中的作用进行了探讨。

首先,MTT实验显示淫羊藿素处理48小时后,HeLa和SiHa两种癌细胞的生长均受到显著抑制(IC50分别为12.5和17μM),而非恶性的CCD?1095Sk成纤维细胞和HEK293人胚肾上皮细胞则只受到轻微影响,说明淫羊藿素对癌细胞有选择性毒性。其次,淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞3小时后,细胞内ROS水平即已显著升高,而用N-乙酰半胱氨酸(NAC)阻断ROS升高后,淫羊藿素的抑制作用即基本消失,说明淫羊藿素引起的ROS升高是其对HeLa和SiHa细胞选择性毒性的基础。接下来的碱性彗星电泳实验表明淫羊藿素处理12小时后,HeLa和SiHa细胞内DNA断裂数量显著上升,加入OGG1 DNA糖苷酶后DNA断裂数进一步升高,而NAC处理阻止了淫羊藿素所致DNA断裂的上升,说明淫羊藿素处理所致ROS升高引起了显著的DNA氧化损伤,由此导致了大量DNA链断裂。

免疫荧光染色发现淫羊藿素处理6小时后γH2AX和53BP1阳性细胞数均显著增多,用NAC处理后显著减少,进一步证明淫羊藿素处理引起了大量DNA损伤并激发了DNA损伤反应(DDR)。Western blot检测发现CDC25C-pS216随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而CDK1-pT14水平下降。流式细胞术检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞24小时后,发生了G2/M期细胞周期阻滞,NAC处理阻断了CDC25C和CDK1蛋白的变化以及G2/M期周期阻滞,显示DNA损伤反应激活了G2/M细胞周期检验点且与淫羊藿素所致ROS有关。

Western blot检测同时显示活化的caspase 3和caspase 9以及Bax蛋白随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而Bcl-2和XIAP蛋白下降;流式细胞术和线粒体膜电位检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞后,凋亡细胞比例呈时间依赖性增加,而NAC处理降低了凋亡蛋白的变化以及凋亡细胞数的上升,显示ROS所致DNA损伤反应同时激活了细胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot检测结果表明淫羊藿素处理前后HPV E6和E7基因的转录和蛋白水平均无明显改变,提示淫羊藿素对HeLa和SiHa的细胞毒性与HPV病毒基因的表达无关。

参考文献

[1]Probing the colorectal cancer proteome for biomarkers:Current status and perspectives[J].Pey Yee Lee;;Siok-Fong Chin;;Teck Yew Low;;Rahman Jamal.Journal of Proteomics,2018

[2]Proteome Heterogeneity in Colorectal Cancer[J].Lay Cheng Lim;;Yang Mooi Lim.PROTEOMICS,2018(3-4)

[3]Feasibility and safety of same-day discharge after laparoscopic radical hysterectomy for cervix cancer[J].Lauren Philp;;Allan Covens;;Danielle Vicus;;Rachel Kupets;;Katherine Pulman;;Lilian T.Gien.Gynecologic Oncology,2017(3)

[4]Deciphering the role of ectosomes in cancer development and progression:focus on the proteome[J].Magdalena Surman;;Ewa St?pień;;Dorota Hoja-?ukowicz;;Ma?gorzata Przyby?o.Clinical&Experimental Metastasis,2017(3-4)

[5]陈欣.淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究[D].吉林大学,2019.