人胚胎干细胞冻存液的应用

背景^[1-3]

人胚胎干细胞冻存液是一款成份明确、不含动物源成份，专用于以单细胞形式冻存人ES/iPS细胞的冻存液。该冻存液是完全的、开盖即用型冻存液，用于冻存在TeSR™1,TeSR™2,或TeSR™-E8™中培养的ES/iPS细胞。hPSC应该被冻存在-135℃或者更冷条件下。

人胚胎干细胞冻存液

优点：

开盖即用，使用方便；

成份明确、不含动物源成份，专用于以单细胞形式冻存人ES/iPS细胞的冻存液；

hPSC解冻后快速复苏；

冻存的hPSC保持了干细胞多能性和扩增能力；

优化用于冻存在TeSR™1,TeSR™2,或TeSR™-E8™中培养的ES/iPS细胞。

胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES细胞的直径7微米～18微米，猪、牛、羊ES细胞的颜色较深，直径12微米～18微米。

应用^[4][5]

人胚胎干细胞冻存液可以用于人胚胎干细胞低温保存问题的初步研究

干细胞研究是探索有关单个细胞发展为一个生物有机体，以及在成熟的机体内健康细胞替换衰老和受损伤细胞的规律和机制的研究。它们在临床的应用前景广阔，最主要和常见的用途是修复或重建患病或损伤的组织。

由于低温能大大降低生物体新陈代谢的速率，所以干细胞能够在液氮温度下安全地保存数十年以上，而不发生变化，因此干细胞低温保存将在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域中发挥重要作用。胚胎干细胞具有广阔的应用前景。

可用于研究人胚胎发育及其疾病的发生；可产生细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官；可发展为特化细胞，从而可望用细胞治疗许多疾病。但体外培养胚胎干细胞条件十分繁琐，而且费时费力。

另外建系后的细胞经长期培养后会出现变异，如核型出现异常，未分化细胞的克隆率相应地减少或降低等。因此，希望能在胚胎干细胞建系后或在其早期传代中，将其加以低温保存，到使用时再将其升温复苏。经低温保存后的胚胎干细胞必须存活，而且要保持其未分化状态及其他生物学特性。

因此低温保存就成为必需解决的急迫问题。国内外对胚胎干细胞的程序降温保存的研究不是很多，一般采用简单的两步降温法。这种慢速冻存与快速复温的方法对鼠胚胎干细胞的保存是有效的，但对于人胚胎干细胞来说，存活率较差。

本文初步研究了人胚胎干细胞低温保存问题，较详细的探讨和比较了几种因素对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响，如：降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度等。

结果表明：采用Me2SO+血清+DMEM(体积比为1:3:6)的保护剂，从0℃开始，以0.5℃／min的速率对细胞悬液降温；至-10℃时对其进行置核，并于-35℃时将其快速投入液氮中保存，复温后效果。冻存复温后细胞存活率可达81.8％，复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同，且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性，同时染色体组型仍正常。

参考文献

[1]Weight and Weight Uniformity of Hard Gelatin Capsules Filled with Microcrystalline Cellulose and Silicified Microcrystalline Cellulose[J].Linda A.Felton;;Daniel I.Garcia;;Ryan Farmer.Drug Development and Industrial Pharmacy,2002(4)

[2]Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems[J].Stephen M.Dang;MichaelKyba;RitaPerlingeiro;George Q.Daley;Peter W.Zandstra.Biotechnol.Bioeng.,2002(4)

[3]Microencapsulated cell-mediated treatment of inoperable pancreatic carcinoma[J]..The Lancet,2001(9268)

[4]Improved survival and ammonia metabolism by intraperitoneal transplantation of microencapsulated hepatocytes in totally hepatectomized rats[J].Yutaka Umehara;;Kenichi Hakamada;;Kageyosi Seino;;Kazunori Aoki;;Yoshikazu Toyoki;;Mutsuo Sasaki.Surgery,2001(3)

[5]杨鹏飞.人胚胎干细胞低温保存问题的初步研究[D].上海理工大学,2005.