大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中肝细胞生长因子(HGF)的含量。

实验原理：大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被肝细胞生长因子(HGF)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝细胞生长因子(HGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA KIT用于肝细胞生长因子HGF介导的胰腺星状细胞促胰腺癌细胞侵袭转移作用及其机制研究

通过检测胰腺星状细胞对胰腺癌细胞侵袭转移的影响,对HGF/c-met信号通路在其中的作用及机制进行初步的探讨,旨在揭示肿瘤微环境在肿瘤恶性行为中的促进作用。

方法:1.测定PSCs对胰腺癌细胞株Panc-1,SW1990侵袭转移力的影响。收集PSCs的上清液作为条件培养基(PSC-CM),并通过细胞划痕实验测定其对两株胰腺癌细胞转移能力的影响;利用Transwell共培养体系将PSCs与胰腺癌细胞进行共培养,测定PSCs对胰腺癌细胞的侵袭转移的影响;

2. 测定PSCs对胰腺癌细胞上皮间质转换(Epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞Panc-1,SW1990后,光镜下观察其形态的变化;利用RT-PCR,Western Blot法分别检测两株胰腺癌细胞E-cadherin、Vimentin的表达变化情况;利用细胞免疫荧光技术检测E-cadherin、Vimentin在胰腺癌细胞内的表达变化情况;

3. 检测HGF对胰腺癌细胞的EMT以及侵袭转移的影响。运用ELISA法分别检测胰腺星状细胞与胰腺癌细胞上清液中HGF的含量;运用RT-PCR,Western Blot法检测胰腺星状细胞与胰腺癌细胞胞内HGF表达的差异;采用si RNA技术干扰胰腺星状细胞胞内中HGF的表达,收集其上清液并测定其对胰腺癌细胞侵袭转移的影响;将胰腺星状细胞上清液中加入HGF-antibody,随后用其培养胰腺癌细胞,观察其对胰腺癌细胞EMT和侵袭转移的影响;将外源性HGF加入到胰腺癌细胞培养基内,观察胰腺癌细胞侵袭转移力的变化;

4. 检测HGF对胰腺癌细胞survivin表达的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞后,采用RT-PCR法、Western Blot法检测胰腺癌细胞内survivin基因的表达水平变化;在胰腺星状细胞条件培养基中加入HGF-antibody并培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内survivin基因的表达水平变化;采用si RNA技术干扰胰腺癌细胞内survivin基因的表达,随后将其与胰腺星状细胞共培养,观察后者对其侵袭转移的促进作用是否被抑制;

5. 检测HGF对其受体c-Met表达的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞后,采用RT-PCR法、Western Blot法检测胰腺癌细胞内c-Met、p-Met基因的表达水平变化;在胰腺星状细胞条件培养基中加入HGF-antibody并培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内c-Met、p-Met基因的表达水平变化;将胰腺星状细胞条件培养基中加入c-Met特异性抑制剂SU11274,随后培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;

6. 检测P53/P21对HGF/c-Met/survivin信号通路的影响。采用RT-PCR法、Western Blot法检测两株胰腺癌细胞内P53,P21的表达水平差异;采用P53抑制剂pifithrin-α干扰癌细胞内P53基因的表达,检测癌细胞内P21、c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;构建P53过表达质粒转染癌细胞使其胞内P53基因过表达,检测癌细胞内P21、c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;采用si RNA-P21干扰癌细胞内P21的表达,随后检测c-Met的表达水平变化;构建P21过表达质粒转染癌细胞使其胞内P21基因过表达,检测c-Met表达水平变化。

参考文献

[1]Curcumin inhibited HGF-induced EMT and angiogenesis through regulating c-Met dependent PI3K/Akt/mTOR signaling pathways in lung cancer[J].Demin Jiao;;Jian Wang;;Wei Lu;;Xiali Tang;;Jun Chen;;Hao Mou;;Qing-yong Chen.Molecular Therapy-Oncolytics,2016

[2]Placental Insufficiency Decreases Pancreatic Vascularity and Disrupts Hepatocyte Growth Factor Signaling in the Pancreatic Islet Endothelial Cell in Fetal Sheep[J].Rozance,Paul J;;Anderson,Miranda;;Martinez,Marina;;Fahy,Anna;;Macko,Antoni R;;Kailey,Jenai;;Seedorf,Gregory J;;Abman,Steven H;;Hay,William W;;Limesand,Sean W.Diabetes,2015(2)

[3]Pancreatic stellate cells and pancreas cancer:Current perspectives and future strategies[J].Jonathan Haqq;;Lynne M Howells;;Giuseppe Garcea;;Matthew S Metcalfe;;Will P Steward;;Ashley R Dennison.European Journal of Cancer,2014(15)

[4]The pancreatic cancer microenvironment:an immunologic battleground[J].Venu G Pillarisetty.OncoImmunology,2014(8)

[5]杨晓鹏.肝细胞生长因子HGF介导的胰腺星状细胞促胰腺癌细胞侵袭转移作用及其机制研究[D].青岛大学,2017.