人肺炎支原体抗体(MP-AB)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人肺炎支原体抗体(MP-AB)ELISA试剂盒用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中肺炎支原体抗体(MP-AB)的含量。

实验原理：人肺炎支原体抗体(MP-AB)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被肺炎支原体抗体(MP-AB)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肺炎支原体抗体(MP-AB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人肺炎支原体抗体(MP-AB)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人肺炎支原体抗体(MP-AB)ELISA试剂盒用于肺炎支原体抗体及肺炎支原体DNA检测在儿童支原体感染中的价值研究

探讨血清肺炎支原体抗体和鼻咽抽吸物(NPA)肺炎支原体DNA检测方法在呼吸道肺炎支原体(MP)感染中的临床意义和价值。

方法:将因呼吸道感染并满足下列条件的患儿为本研究对象。研究对象条件:年龄1个月～14岁;入院后采集鼻咽抽吸物(NPA)标本,并采用实时聚合酶链反应(PCR)技术进行MP-DNA检测;检测急性期和恢复期双份血清MP-IgM和IgG的滴度;排除免疫抑制患儿及接受过免疫抑制治疗的患儿。

满足条件共2839例患儿。所有研究对象入院后24小时内采集外周静脉血样本,出院前(治疗7～10天病情好转时)采集第二份外周静脉血样,进行血清MP特异性抗体检测。入院24h内采集NPA1～2mL,采用实时荧光定量PCR法进行NPA MP-DNA检测。实验室检测判断MP阳性标准:(1)实时荧光定量PCR法检测NPA MP-DNA,拷贝数>1x104。

(2) 入院24h内外周静脉血半定量法检测MP-IgM结果,比值>1.1。

(3) 出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低。MP感染确诊标准:NPA MP-DNA拷贝数>1x104,以及NPA MP-DNA拷贝数小于1x104但出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低。收集入组患儿的临床资料,包括年龄、性别、病程及临床症状、临床诊断、相关实验室检查等,根据不同方法检测MP结果进行比较研究。

结果:1.2839例入院后采集NPA标本进行MP-DNA检测以及检测急性期和恢复期双份血清MP-IgM和IgG滴度的患儿,其中NPA MP-DNA拷贝数>1 x 104有350例,NPA MP-DNA拷贝数小于1x104的患儿中,出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低有250例。MP阳性检出共600例,总MP阳性检出率21.13%(600/2839)。

2.2839例NPA标本实时荧光定量PCR法检测MP-DNA,阳性检出率12.33%(350/2839);入院24h内外周静脉血(份血清)半定量法检测MP-IgM,阳性检出率23.11%(656/2839);出院前与入院24h内外周静脉血(双份血清)MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低,阳性的患儿为394例,阳性率为13.88%(394/2839)。份血清MP-IgM阳性检出率明显高于NPA MP-DNA及双份血清MP-IgM、MP-IgG检测,差异有统计学意义(χ2=140.371,P<0.001)。

将600例确诊支原体感染的患儿按照年龄组分别进行NPAMP-DNA及MP双份血清抗体阳性检出率比较,≤1岁组NPAMP-DNA阳性检出率为71.76%(122/170)明显高于MP双份血清抗体的41.18%(70/170),两者相比有统计学意义(χ2=32.354,P<0.001);～3岁组NPAMP-DNA阳性检出率与MP双份血清抗体,两者相比无统计学意义(P=0.204);～6岁组NPAMP-DNA阳性检出率57.14%(84/147)明显低于MP双份血清抗体的79.59%(117/147),两者比较差异有统计学意义(χ2=17.128,P<0.001);>6岁NPA MP-DNA阳性检出率40.43%(38/94),明显低于MP双份血清抗体的85.11%(80/94),两者相比有统计学意义(χ2=40.149,P<0.001)。MP双份血清抗体检测法及NPA MP-DNA在不同年龄组比较,阳性检出率差异均有统计学意义(P<0.001)。

参考文献

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[5]张秋燕.肺炎支原体抗体及肺炎支原体DNA检测在儿童支原体感染中的价值研究[D].苏州大学,2020.