人泛素分解酶(DUB)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人泛素分解酶(DUB)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中泛素分解酶(DUB)的含量。

实验原理：人泛素分解酶(DUB)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被泛素分解酶(DUB))捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的泛素分解酶(DUB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人泛素分解酶(DUB)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人泛素分解酶(DUB)ELISA KIT用于雄激素拮抗糖皮质激素引起的大鼠骨骼肌萎缩的作用与机制研究

研究通过动物实验旨在阐明雄激素对糖皮质激素引起的大鼠骨骼肌萎缩(特别是骨骼肌蛋白高分解代谢)的拮抗作用，并探讨与骨骼肌蛋白代谢密切相关的IGF-1信号传导通路在雄激素拮抗糖皮质激素引起的骨骼肌萎缩中的作用。

方法：雌性SD大鼠160只，随机分为四组：(1)对照组注射生理盐水与香油(分别为地塞米松与睾酮的溶剂)；(2)地塞米松组注射地塞米松与香油；(3)睾酮组注射生理盐水与睾酮；(4)睾酮+地塞米松组注射地塞米松与睾酮。分别在开始注射地塞米松或生理盐水后1天、3天、5天、10天麻醉后处死动物，每个时间点10只动物，留取肌肉(腓肠肌、趾长伸肌、比目鱼肌、胫骨前肌、跖肌)、血浆与尿标本。实验过程中每日称量体重，实验结束时称量肌肉重量。肌纤维横断面在HE染色或免疫组化染色之后采用图像采集与分析系统计算横断面面积；骨骼肌中与尿中3-甲基组氨酸(3-MH)采用高效液相色谱分析技术进行检测；血浆睾酮水平采用放射免疫学方法进行检测；血浆IGF-1蛋白水平采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测；骨骼肌中蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、70kDa核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)的活性采用Western blot方法进行检测；骨骼肌中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)与二种泛素蛋白连接酶muscle atrophy F-box(MAFbx)、muscle RING finger-1(MuRF1)mRNA的表达采用定量PCR方法进行检测。

结果：1．地塞米松使大鼠体重和多种肌肉重量进行性降低，并使多种肌肉的肌纤维横断面面积减小。睾酮可以部分拮抗地塞米松引起的大鼠体重、肌肉重量的降低和肌纤维横断面面积的减小。

2．睾酮可以部分拮抗地塞米松引起的大鼠腓肠肌中3-MH含量和尿中3-MH释放量的增加。

3．睾酮可以拮抗地塞米松引起的大鼠腓肠肌中IGF-1 mRNA表达的下降，但不能拮抗地塞米松引起的大鼠血浆中IGF-1蛋白水平的下降。

4．地塞米松可以明显降低大鼠腓肠肌中Akt、p70S6K的活性；睾酮可以增加腓肠肌中Akt、p70S6K的活性，降低GSK-3p的活性，并可以部分拮抗地塞米松对Akt、p70S6K活性的影响。

5．地塞米松可使大鼠腓肠肌中泛素蛋白连接酶MuRF1与MAFbx mRNA表达明显上调，而睾酮并不能拮抗地塞米松对这二种基因表达的影响。

参考文献

[1]Androgen regulation of a laryngeal-specific myosin heavy chain mRNA isoform whose expression is sexually differentiated.Catz DS,Fischer LM,Kelley DB.Dev Biol.1995

[2]Influence of burn injury on protein metabolism in different types of skeletal muscle and the role of glucocorticoids.Fang CH,James H J,Ogle C,et al.J Am Coll Surg.1995

[3]Androgen therapy improves muscle mass and strength but not muscle quality:results from two studies.Schroeder ET,Terk M,Sattler FR.Am J Physiol Endocrinol Metab.2003

[4]Hydroxyl Radical Formation in Skeletal Muscle of Rats with Glucocorticoid-Induced Myopathy[J].Shingo Konno.Neurochemical Research,2005(5)

[5]尹会男.雄激素拮抗糖皮质激素引起的大鼠骨骼肌萎缩的作用与机制研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2007.