三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的使用说明

TCEP盐酸盐，即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐是一种有效的、通用的、无臭的且不含硫醇的还原剂，广泛应用于蛋白质和其他涉及二硫键还原的研究。该产品在很多溶剂中有较好的溶解度和稳定性，还原二硫键的效果与DTT相似，但是又不像DTT或其他含硫还原剂必须在巯基交联反应前去除。

TCEP还原有机二硫键

三烷基膦化合物还原蛋白质二硫键的能力和优点早已为人们所熟知，但由于在水中溶解度差以及难闻的气味导致应用较少。磷酸盐在水溶液中较稳定，可以选择性断裂二硫键，并且对其他官能团几乎没有作用，三（2-羧乙基）膦（TCEP）的发现克服了三烷基膦化合物的缺点从而被广泛应用。

TCEP在较宽的pH范围可以选择性地、彻底地还原在水中稳定的烷基二硫化合物，室温条件下还原甚至不到5分钟。TCEP没有挥发性、无刺激性气味，也不像其他大部分还原剂在空气中易被氧化。与DTT相比，TCEP更稳定、活性更强，并且可以在低pH值时还原二硫键。

1. 溶解度

三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（分子量：286.65）在水中有很好的溶解度，可达到310g/L（1.08M）。作为亲水性化合物，在水缓冲液中TCEP几乎在任何pH下都有非常好的溶解性，因此在大部分水缓冲液中的反应浓度和10X的存储液很容易制备。TCEP在有机溶剂中有较小溶解度的只有甲醇和乙醇。

2. 在溶液中稳定性

TCEP在水、酸和普通溶液中非常稳定，溶于水中的pH约为2.5。研究指出，室温下TCEP在100mM HCl或100mM NaOH溶液中放置24小时无变化，同样在如下50mM缓冲液中也无变化：Tris•HCl（pH 7.5, 8.5和9.5）、HEPES（pH6.8和8.2）、硼酸盐缓冲液（pH8.2和10.2）和CAPS（pH9.7和11.1），甚至TCEP在这些缓冲液中三周，被氧化部分也少于20%。

TCEP在磷酸盐缓冲液中并不是特别稳定，尤其是在中性pH条件下。实验指出在pH值为7.0的0.35M磷酸盐缓冲盐（PBS）中72小时内被完全氧化，与在pH值为8.0的0.15M PBS中约50%被氧化的时间相同。只有在pH>10.5或<6.0的PBS中，TCEP才只发生轻微氧化。因此，如果在PBS缓冲液中使用TCEP，现配现用。

3. 还原活性的pH范围

TCEP可以在较宽的pH范围有效的还原二硫键，实验表明TCEP在1.5<pH<9.0之间，30秒内即可完全还原2,2′二硫代二吡啶（2,2′-DTDP），但在pH＞9时，只有50%的2,2′-DTDP被还原。在pH<8.0时，TCEP比DTT效果更好，甚至可以还原被氧化的DTT。

4. 反应浓度

对于大多数反应，室温下5-50mM TCEP可以提供足够的摩尔浓度在几分钟内有效还原肽或蛋白质的二硫键。pH在1.5-8.5之间时，30µM的TCEP可以在40秒内将2,2′-DTDP(20µM) 完全还原。当使用等摩尔量的TCEP时反应时间将延长很多，Mery报告显示TCEP与二硫化合物摩尔比1:1时，反应时间将近一小时。

5. 使用兼容性

因为TCEP不含硫醇，因此不需要在马来酰亚胺标记或交联反应前去除。大多数情况下，TCEP浓度小于10-20mM时，与马来酰亚胺的化学反应也是可以兼容的。

TCEP（50mM）可以替代DTT或2-巯基乙醇作为SDSPAGE的还原样品缓冲液，然而因为TCEP在溶液中带电荷，所以不适合二维等电聚焦电泳（IEF）。