人抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人抗蛋白酶3抗体IGG(PR3 AB-IGG)ELISA试剂盒用于血清抗中性粒细胞胞浆抗体阳性狼疮性肾炎患者的临床病理特征及预后研究

研究血清中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）阳性狼疮性肾炎（LN）患者的临床、病理特征、预后及危险因素。

方法:收集诊断为血清ANCA阳性LN患者,根据这部分患者的血清ANCA类型分为MPO-ANCA阳性和PR3-ANCA阳性,比较两组患者的临床、病理特征、预后及危险因素。

结果:符合入选标准的99例患者中,69例MPO-ANCA阳性,26例PR3-ANCA阳性,4例MPO-ANCA和PR3-ANCA双阳性。女性88例,男性11例。

中位年龄34（25-43）岁。ANCA阳性LN患者,尿沉渣红细胞计数为162万/mL、血清肌酐为92.8μmol/L、SLE-DAI评分为15分;病理类型以IV型为主,占50.5%;光镜下,细胞/细胞纤维性新月体、间质炎症细胞浸润评分和纤维性新月体评分均较高。

血清MPO-ANCA阳性患者较PR3-ANCA阳性患者,SCr更高（109.6μmol/L vs.74.3μmol/L,P=0.02）;病理提示慢性指数（CI）评分较高（P=0.007）,其中肾小管萎缩病变（P=0.03）和间质纤维化病变（P=0.001）较重。诱导治疗后,MPO-ANCA阳性患者的完全缓解率（69.6%vs.84.6%,P=0.1）和总缓解率（81.2%vs.88.5%,P=0.02）均低于PR3-ANCA阳性患者。MPO-ANCA阳性组有15例患者（15.2%）发生终末期肾病（ESRD）,PR3-ANCA阳性组没有患者发生ESRD。MPO-ANCA阳性患者,其1年、5年、10年肾脏生存率分别为94.11、83.33、79.7%,低于PR3-ANCA阳性患者（1年、5年、10年肾脏生存率均为100.0%）,但未达到统计学差异（P=0.05）。

单因素分析显示:eGFR＞60mL/min/per1.73m2,患者预后,eGFR＜30mL/min/per1.73m2,患者预后最差;接受吗替麦考酚酯（MMF）治疗患者预后较好;肾脏病理CI≥4分的患者预后较差;血清MPO-ANCA阳性患者的远期预后较差。多因素分析显示:eGFR的HR为0.96（95%CI 0.94-0.98,P=0.001）,接受MMF诱导治疗的HR为0.13（95%CI 0.03-0.59,P=0.008）。

结论:血清ANCA阳性LN患者肾脏表现为大量的血尿,病理类型以IV型LN为主,有较多新月体形成。MPO-ANCA阳性患者肾功能较PR3-ANCA阳性患者更差,病理提示慢性病变更重,诱导治疗后缓解率更低,预后更差。eGFR和接受MMF诱导治疗是这部分患者发生ESRD的独立性保护因素。

参考文献

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[5]李翠.血清抗中性粒细胞胞浆抗体阳性狼疮性肾炎患者的临床病理特征及预后[D].南京大学,2017.