胸苷磷酸化酶抗体的应用

背景^[1-3]

胸苷磷酸化酶抗体是一类可以特异性结合胸苷磷酸化酶的多克隆抗体，主要用于体外检测胸苷磷酸化酶的免疫学实验。

胸苷磷酸化酶（Thymidine Phosphorylsae,TP）是嘧啶核苷磷酸化酶家族成员之一,是合成DNA及细胞生长的必需酶。近年来,有报道显示,TP与血小板衍生内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF）为同一种因子,在多种实体肿瘤中过度表达,并与肿瘤新生微血管形成、临床病理特征及肿瘤化疗有关。

胸苷磷酸化酶

磷酸化酶(phosphorylase)，可添加磷酸基团到受体上。以无机酸磷酸作为磷酸基团供体。糖基转移酶类下的一个组群，即专司催化磷酸解作用的一类酶总称。广泛分布于动物(肝、肌)、植物、微生物中，包括糖原磷酸化酶(glycogenphosphorylase，EC2.4.1.1，分子量3.7×105)、麦芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8.)、1,3-β-D-低聚葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.30.)、海带二糖磷酸化酶(1aminaribiose phosphorylase EC 2.4.1.31.)、纤维糊精磷酸化酶(EC2.4.1.49.)、1，3-β-D-葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.97.)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2.)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3.)、胸腺嘧啶磷酸化酶(EC2.4.2.4.)、鸟苷磷酸化酶(EC2.4.2.15.)等。例如最有代表性的磷酸化酶是糖原磷酸化酶，糖原在体内降解过程中，该酶是催化糖原还原性末端葡萄糖残基的d-1,4-糖苷键断裂，反应，生成1-磷酸葡萄糖和少了一个葡萄糖基的糖原分子(见图)。这类酶多数是作为生化试剂应用于研究。

应用^[4][5]

胸苷磷酸化酶抗体用于胸苷磷酸化酶在肿瘤中表达的研究研究

胸苷磷酸化酶（Thymidine Phosphorylase，TP）（E．C．2．4．2．4）在体内可特异性的催化胸苷生成胸腺嘧啶和1-磷酸-2-脱氧核糖。近年来的研究表明1-磷酸-2-脱氧核糖在细胞内的衍生物——2-脱氧-D-核糖是一种内皮细胞的化学趋化因子和血管生成诱导因子，因此它除了在核苷酸补救合成途径中扮演重要的角色外，还有促血管生成的活性。研究表明，胸苷磷酸化酶在许多肿瘤组织中都有异常的高表达，是促进肿瘤血管生成和肿瘤转移的一个重要因素。Furtulon（5’-DFUR）和Capecitabine（fluoropyrimidine）等5-FU的前药，在体内只有被胸苷磷酸化酶转变成5-FU才能最终起作用。同5-FU相比，它们对于胸苷磷酸化酶高表达的肿瘤细胞有着极高的靶向性。国外有关胸苷磷酸化酶的研究一直围绕着胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的高表达，以及研究胸苷磷酸化酶促血管生成的机制和在肿瘤抗血管生成治疗中的应用。至于，胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的特异性高表达的机制和胸苷磷酸化酶在肿瘤抗血管生成治疗中应用价值的评估却很少有研究涉及。

1．在原核系统中表达并纯化人胸菩磷酸化酶；制备、纯化及鉴定兔抗人胸旮磷酸化酶多克隆抗体。

2．研究对比具有不同增殖能力的细胞中胸菩磷酸化酶的表达是否有差异。采用RTP C R和免疫印迹的方法分别研究胸菩磷酸化酶在胆囊癌、胆管癌和正常胆囊组织中的表达；采用免疫组化的方法研究胸旮磷酸化酶在胃癌和肺癌浸润部位和非浸润部位的表达；采用RTPCR和免疫组化的方法分别研究痰痕疙瘩和正常皮肤组织中成纤维细胞胸菩磷酸化酶的表达。

3．从体内和体外两种角度的研究中对比胸菩磷酸化酶表达的差异，进而探讨体内微环境是否对胸菩磷酸化酶的表达有影响。采用RTI C R、免疫印迹和免疫组化的方法分别研究胸菩磷酸化酶在痰痕疙瘩和正常皮肤组织及原代培养的疯痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达。

4.研究胸菩磷酸化酶在肿瘤组织中高表达可能的调控机制。在体外细胞培养实验中，模拟体内肿瘤微环境中胸旮升高的现象，进而研究胸旮对胸菩磷酸化酶表达的影响。

5．研究低血管生成的部位胸菩磷酸化酶是否高表达。采用RT-PCR、免疫印迹和免疫组化的方法分别研究胸菩磷酸化酶在胆囊癌、胆管癌和疯痕疙瘩组织中的表达。

6．研究胸菩磷酸化酶在多种细胞中的分泌表达。体外培养多种细胞，检测上清中胸菩磷酸化酶的表达。

7．构建了人胸旮磷酸化酶的正义和反义真核表达载三南京医科大学硕士学位论文体，制备胸蔷磷酸化酶的重组腺病毒表达载体。研究方法和结果：1．采用p Q E和p E T融合蛋白表达系统，在大肠杆菌B L上，J MIO 9中表达N－末端带有6个连续组氨酸的重组人胸菩磷酸化酶，蛋白产物通过N iN TA亲和层析系统纯化。所构建的原核表达载体已通过鉴定，在大肠杆菌B L 21、J MIO 9中得到高效表达（2 0刁0O）并纯化（电泳纯）。

2．取纯化的重组人胸旮磷酸化酶分别免疫LCR，J、鼠及家兔，制备兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶多克隆抗体。采用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析系统纯下匕兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶抗血清，ELISA法测定抗体的滴度。兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶抗血清的滴度分别达到1：10万和1：3．2万。

3．采用IP-R、免疫印迹和免疫组化的方法分别研究胸菩磷酸化酶mRNA和蛋白在多种组织中的表达。疯痕疙瘩组织中胸旮磷酸化酶mRNA和蛋白水平均高于正常皮肤组织。胆囊癌、胃癌、肺癌和肝癌组织中胸旮磷酸化酶的表达高于癌旁组织，并且在肿瘤浸润部位的表达高于非浸润部位。

参考文献

[1]Biocatalytic approaches applied to the synthesis of nucleoside prodrugs[J].Luis E.Iglesias,Elizabeth S.Lewkowicz,Rosario Medici,Paola Bianchi,Adolfo M.Iribarren.Biotechnology Advances.2015(5)

[2]Nucleoside antibiotics:biosynthesis,regulation and biotechnology[J].Guoqing Niu,Huarong Tan.Trends in Microbiology.2014

[3]Enzymatic synthesis of 2′-deoxyuridine by whole cell catalyst co-expressing uridine phosphorylase and thymidine phosphorylase through auto-induction system[J].Shuli Xiong,Yingbin Wang,Xi Wang,Jie Wang,Jie Li,Guiyou Zhang,Rongqing Zhang,Liping Xie,Hongzhong Wang.Journal of Bioscience and Bioengineering.2014

[4]Display of Eimeria tenella EtMic2 protein on the surface of Saccharomyces cerevisiae as a potential oral vaccine against chicken coccidiosis[J].Hui Sun,Longjiang Wang,Tiantian Wang,Jie Zhang,Qing Liu,Peipei Chen,Zhengtao Chen,Fangkun Wang,Hongmei Li,Yihong Xiao,Xiaomin Zhao.Vaccine.2014

[5]王若宁. 胸苷磷酸化酶在肿瘤中表达的研究[D].南京医科大学,2002.