腺苷酸激酶抗体的应用

背景^[1-3]

腺苷酸激酶抗体是一类可以特异性结合腺苷酸激酶的多克隆抗体，主要用于体外检测腺苷酸激酶的免疫学实验。

腺苷酸激酶adenylate kinase催化腺苷三磷酸（ATP）使腺苷酸（AMP）磷酸化而生成腺苷二磷酸（ADP）反应的酶，EC 2．7．4．3．逆反应由2个分子ADP生成ATP和AMP。

最初为科洛韦克和卡尔查尔（S．P．Colowick andH．M．Kalckar，1943）在肌肉中发现，称为肌激酶。已知在肝脏、肾脏、微生物中都存在。脱氧腺苷酸也可以作为底物。此酶特别稳定，即使在0.1NHCl中加热到100℃，或用三氯乙酸处理，也不易失去活性。但可由氧化剂或SH试剂或胰蛋白酶的作用而失活。需要有Mg2+存在。

腺苷酸激酶抗体

肌激酶亦称腺苷酸激酶，可逆地催化两分子ADP产生一分子ATP及一分子AMP的酶。在哺乳动物中存在三种同工酶，即AK1、AK2和AK3。腺苷酸激酶(肌激酶)（AK）家族同工酶是细胞内核苷酸合成的机器。核苷酸既是核酸结构的组成部分，又在细胞代谢、许多生物合成途径以及细胞信号转导中作为化学能的来源或作为活化的中间体，又或作为辅酶的成分发挥作用。由于细胞膜上没有其相应的载体蛋白，并且带负电荷的磷酸基团会阻止其通过膜扩散，所以所有核苷酸需要在细胞内合成。在哺乳动物细胞中核苷酸的合成有两种途径，一种称为从头合成途径，另一种为补救途径，这两种途径都涉及到许多核苷和核苷酸激酶。核苷酸合成缺陷会引起一些疾病，但现缺乏有效的治疗方法。增加有关核苷酸的合成代谢途径知识，对于疾病的诊断和治疗非常重要。

应用^[4][5]

腺苷酸激酶抗体用于甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及载体构建研究

采用RACE技术从自有淀粉专用型甘薯新品种“渝苏303”（国审薯2002006）中克隆了ADK基因cDNA全长，并对该基因及其所编码的ADK蛋白进行了详尽的生物信息学分析和组织表达谱分析。

获得结果如下：根据已知腺苷酸激酶基因的保守序列设计引物，扩增获得592bp的核心片段；BLAST分析表明该片段与其它植物ADK同源，初步确定为甘薯的ADK基因核心片段；根据该序列设计用于3’-RACE和5’-RACE的基因特异性引物，扩增获得548bp的3’-末端和314bp的5’-末端；将核心片段、3’-末端和5’-末端序列进行拼接，获得甘薯ADK基因的cDNA电子全长，进而设计引物扩增获得其物理全长。

IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白（IbADK）；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46；BLAST分析显示IbADK与马铃薯ADK序列相似性达到83％；亚细胞定位预测IbADK的N-端有一段长度为22个氨基酸残基的质体转运肽，表明该蛋白定位于质体，这与淀粉合成定位于质体相一致；将IbADK与植物ADKs构建分子发育树，发现马铃薯ADK蛋白与IbADK聚为一类，表明两者在进化上比较接近，这与BLAST结果相符；对IbADK进行二级结构预测，表明其中包含26.06％的α-螺旋、23.59％的片层和50.35％的随机卷曲；进一步对IbADK进行三维结构建模，表明该蛋白能够正常折叠形成典型的ADK蛋白三维结构，并在其三维结构中发现了AMP结合位点和ATP-AMP（Ap5A）结合位点；利用半定量RT-PCR技术对IbADK进行组织表达谱分析，表明该基因在块根和幼叶中表达量最高，在成熟叶片和茎中表达量次之，在叶柄中则检测不到IbADK的表达。

已有研究表明，淀粉合成定位于两种质体，即叶片中的叶绿体和块根中的淀粉体。因此在甘薯块根和幼叶中IbADK的高表达，有利于促进这两种代谢活跃的组织中ATP、AMP和ADP分子的代谢，进而调节淀粉代谢和核苷酸代谢。对IbADK的克隆分析和性质研究，有助于在分子遗传学水平上了解IbADK的功能，并且对于研究甘薯淀粉合成的分子机理有一定帮助。前人研究表明：适当下调ADK表达量，可以促使腺苷酸代谢库向淀粉合成的方向流动。

本研究设计一对带酶切位点的引物，克隆IbADK的编码区，反向插入到植物表达载体pHB中，构建IbADK反义表达载体pHB-aIbADK，同时构建正义表达载体pHB-IbADK作为对照，将pHB-aIbADK和pHB-IbADK分别导入根癌农杆菌LBA4404和“解除武装”的C58C1，获得农杆菌工程菌。构建的反义表达工程菌不但可用于在分子遗传学水平探讨ADK在甘薯淀粉生物合成中的作用机理，而且可进一步用于遗传转化甘薯，获得低ADK表达的转基因甘薯，为实现甘薯淀粉代谢工程，最终获得转基因修饰的高淀粉甘薯新材料或新品种奠定基础。

参考文献

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[3]Increased levels of adenine nucleotides modify the interaction between starch synthesis and respiration when adenine is supplied to discs from growing potato tubers[J].Irene Loef,Mark Stitt,Peter Geigenberger.Planta.2001(5-6)

[4]The contribution of adenosine 5′-diphosphoglucose pyrophosphorylase to the control of starch synthesis in potato tubers[J].Lee J.Sweetlove,Bernd Müller-R?ber,Lothar Willmitzer,Steven A.Hill.Planta.1999(3)

[5]曾令江.甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及载体构建[D].西南大学,2007