人生长激素结合蛋白(GHBP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人生长激素结合蛋白(GHBP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人生长激素结合蛋白(GHBP)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人生长激素结合蛋白(GHBP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人生长激素结合蛋白(GHBP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人生长激素结合蛋白(GHBP)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于特发性矮小与生长激素结合蛋白的研究

从GHBP方面对ISS进行研究，探讨其与ISS的关系及临床意义。

方法：1、收集矮小症儿童235例。根据生长激素（growth hormone，GH）激发试验GH峰值＞10ng/ml、5～10ng/ml、＜5ng/ml，将矮小儿童分为特发性矮小（ISS，115例）、部分生长激素缺乏（[partialgrowth hormone deficiency，pGHD），70例]及生长激素缺乏组[（growth hormonedeficiency，GHD），50例]。选择115例ISS患儿为实验组，健康体检儿童45例作为正常对照组。

2、将ISS组与正常对照组GHBP水平进行比较。

3、分析ISS组GHBP与GH峰值的关系。

4、比较34例使用GH治疗并每3个月随诊的ISS患儿治疗前、治疗后3个月、治疗后6个月血清GHBP水平。

5、采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清GHBP水平，采用t检验及直线回归分析等统计学方法对结果进行分析。

结果：1、ISS组血清GHBP水平高于正常对照组[（264.30±149.91）pmol/L vs（102.45±16.24）pmol/L，P＜0.05]。

2、ISS组血清GHBP水平与GH峰值无明显相关性。

3、34例ISS患儿治疗3个月后、治疗6个月后与治疗前相比，GHBP明显下降（P＜0.05）。

结论：1、ISS组与正常对照组之间血清GHBP水平有显著差异，ISS组明显高于对照组水平。GHBP可能与ISS的发生有关。

2、将ISS患儿GHBP与GH峰值进行相关分析，结果显示两者之间无明显相关性。正常人体GH的分泌存在昼夜节律性，但GHBP并无此节律性，这可能更有利于它对GH调节，维持血GH浓度达到稳定。

3、ISS治疗后GHBP水平较治疗前明显降低，且患儿身高标准差积分（heightstandard deviation score，HtSDS）较治疗前有提高，提示GHBP可以作为ISS临床疗效的监测指标。

参考文献

[1]Nonalcoholic fatty liver disease is associated with increased GHBP and reduced GH/IGF‐I levels[J].Alessandra Fusco,Luca Miele,Annalisa D’Uonnolo,Alessandra Forgione,Laura Riccardi,Consuelo Cefalo,Angela Barini,Antonio Bianchi,Antonella Giampietro,Vincenzo Cimino,Raffaele Landolfi,Antonio Grieco,Laura De Marinis.Clinical Endocrinology.2012(4)

[2]Genome-wide association approaches for identifying loci for human height genes[J].Markus Perola.Best Practice＆Research Clinical Endocrinology＆Metabolism.2010(1)

[3]Genetic evaluation of short stature[J].J.M.Wit,W.Kiess,P.Mullis.Best Practice＆Research Clinical Endocrinology＆Metabolism.2010(1)

[4]Rapid and high throughput genotyping of the growth hormone receptor exon 3 deleted/full-length polymorphism using a tagSNP[J].Camilla A.M.Glad,Gudmundur Johannsson,Lena M.S.Carlsson,Per-Arne Svensson.Growth Hormone＆IGF Research.2010(3)

[5]陈卡.特发性矮小与生长激素结合蛋白的研究[D].南昌大学,2013.