人环磷酸鸟苷(CGMP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人环磷酸鸟苷(CGMP)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中环磷酸鸟苷(CGMP)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗环磷酸鸟苷(CGMP)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的环磷酸鸟苷(CGMP)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗环磷酸鸟苷(CGMP)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，环磷酸鸟苷(CGMP)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中环磷酸鸟苷(CGMP)的浓度。

人环磷酸鸟苷(CGMP)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于乙型肝炎患者血清5羟色胺与环磷酸鸟苷含量检测及意义研究

通过对急、慢性乙型肝炎患者和正常对照组血清中CGMP、5-HT、ALT、AST水平的检测和相关性的分析，进一步探讨Ⅰ型超敏反应在乙型肝炎发病机制中的作用及相关性。

方法：选择45例急、慢性乙型肝炎患者及30例正常对照组，采用酶联免疫吸附实验—双抗体夹心法，检测患者和对照组血清中CGMP与5-HT浓度；应用全自动生化分析仪同步检测血清中ALT与AST水平，并与血清中CGMP与5-HT浓度做相关性分析。

结果：①急性乙型肝炎患者血清5—HT和CGMP含量明显高于对照组；②39例慢性乙型肝炎患者血清CGMP和5—HT含量均明显高于正常对照组，其中慢性重度组升高明显，其次为中度组和轻度组；③患者血清中CGMP和5—HT含量与血清ALT，AST水平呈正相关。

结论：①急、慢性乙型肝炎患者血清中CGMP、5—HT水平可反应肝脏损害程度；②检测急、慢性乙型肝炎患者血清中CGMP、5—HT水平对判断患者病情和预后有一定参考价值；③结合本课题组的其他研究结果，进一步佐证了Ⅰ型超敏反应参与了乙型肝炎患者的肝细胞免疫损伤过程的可能性。

参考文献

[1]Melatonin enhances antioxidative enzyme gene expression（CAT,GPx,SOD）,prevents their UVR‐induced depletion,and protects against the formation of DNA damage（8‐hydroxy‐2’‐deoxyguanosine）in ex vivo human skin[J].Tobias W.Fischer,Konrad Kleszczyński,Lena H.Hardkop,Nathalie Kruse,Detlef Zillikens.J.Pineal Res..2012(3)

[2]cGMP and cyclic nucleotide-gated channels participate in mouse sperm capacitation[J].Abraham Cisneros-Mejorado,Daniel P.Sánchez Herrera.FEBS Letters.2011(2)

[3]Increased levels of oxidants and reduced antioxidants in semen of infertile men with varicocele[J].Mohamed Ahmed Abd-Elmoaty,Ramadan Saleh,Rakesh Sharma,Ashok Agarwal.Fertility and Sterility.2010(4)

[4]Impact of estrogenic compounds on DNA integrity in human spermatozoa:Evidence for cross-linking and redox cycling activities[J].L.E.Bennetts,G.N.De Iuliis,B.Nixon,M.Kime,K.Zelski,C.M.McVicar,S.E.Lewis,R.J.Aitken.Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.2008(1)

[5]陈宁.乙型肝炎患者血清5羟色胺与环磷酸鸟苷含量检测及意义[D].延边大学,2007.