人周期素依赖性激酶4(CDK-4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人周期素依赖性激酶4(CDK-4)ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中周期素依赖性激酶4(CDK-4)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗周期素依赖性激酶4(CDK-4)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的人周期素依赖性激酶4(CDK-4)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗人周期素依赖性激酶4(CDK-4)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，周期素依赖性激酶4(CDK-4)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中周期素依赖性激酶4(CDK-4)的浓度。

人周期素依赖性激酶4(CDK-4)ELISA试剂盒

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂LEE011的抗宫颈癌活性及机制研究

探索LEE011抗宫颈癌细胞活性的分子机制及其与Rb-E2F信号通路的关系。

检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclin D1的本底表达量,以明确LEE011作用于相关信号通路的可行性;检测Rb-E2F信号通路上游通路相关蛋白CDK4、CDK6和cyclin D1及CDK2和cyclin E1的表达量,以明确LEE011抑制细胞增殖过程中细胞周期调控相关通路信号分子的改变;检测凋亡通路中相关蛋白的表达量,以明确LEE011诱导细胞凋亡过程中凋亡通路相关信号分子的改变。方法:细胞免疫荧光技术和western blotting技术来检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclin D1的本底表达量;Western blotting技术检测不同浓度LEE011（0,5,10,15,20μM）处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平的变化。

结果:通过细胞免疫荧光技术和western blotting技术检测发现,宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中存在高水平表达的CDK4、CDK6和cyclin D1,且主要定位细胞核内。通过western blotting技术检测不同浓度LEE011（0,5,10,15,20μM）处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平,发现CDK4、CDK6、E2F1、P-Rb、P16、cyclin E1、CDK2等周期相关蛋白存在剂量依赖性的表达量下调;凋亡蛋白也存在剂量依赖性现象,Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量下调。但是LEE011处理的HeLa细胞中细胞周期调控相关通路及凋亡通路信号分子无明显改变。结论:LEE011可能通过Rb-E2F信号通路来阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡,从而发挥抗宫颈癌C33A细胞活性;然而该通路在宫颈癌HeLa细胞中无明显改变,有待进一步研究。

LEE011在裸鼠移植瘤模型中抗宫颈癌活性研究目的:在裸鼠移植瘤模型中验证LEE011的抗宫颈癌活性及其作用机制,并评估LEE011在体内的药物安全性与毒性反应。方法:裸鼠腋下种植宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞,建立宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型。设置LEE011处理组及对照组,每组5只;其中LEE011处理组裸鼠除正常饮食外经灌胃给予LEE011（200mg/kg/day）,对照组裸鼠除正常饮食外给予等量溶剂（0.5%甲基纤维素）处理。每3天监测荷瘤裸鼠的体重、肿瘤体积变化及生存情况,总计21天;通过免疫组化方法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中CDK4、CDK6、cyclin D1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平;通过TUNEL法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平变化;通过眼球取血法,血液生化分析荷瘤裸鼠的生化指标ALT、AST、ALB、ALP、BUN、CR、LDH-L及CK的水平变化;通过HE染色法观察荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学变化。

参考文献

[1]Cancer statistics,2019[J].Rebecca L.Siegel MPH,Kimberly D.Miller MPH,Ahmedin Jemal DVM,PhD.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2019(1)

[2]Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitors as anticancer drugs[J].Robert Roskoski.Pharmacological Research.2018

[3]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[4]Cyclin E overexpression confers resistance to the CDK4/6 specific inhibitor palbociclib in gastric cancer cells[J].Ahrum Min,Jung Eun Kim,Yu-Jin Kim,Jee Min Lim,Seongyeong Kim,Jin Won Kim,Kyung-Hun Lee,Tae-Yong Kim,Do-Youn Oh,Yung-Jue Bang,Seock-Ah Im.Cancer Letters.2018

[5]熊宇迪.细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂LEE011的抗宫颈癌活性及机制研究[D].武汉大学,2019.