人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)的含量。

实验原理

人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-AB)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于不孕症患者甲状腺功能、甲状腺自身抗体与血清IL-6关系的研究

不孕症的原因有多种,甲状腺功能减退（hypothyroidism,甲减）可以通过各种途径影响生殖功能,但其具体机制尚不明确,本研究通过检测不孕症女性与正常育龄期女性血清白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、甲状腺激素、甲状腺自身抗体的水平,了解不孕症患者IL-6与甲状腺功能、甲状腺自身免疫的关系,初步探索合并甲状腺功能减退或甲状腺自身免疫的不孕症女性血清炎症指标的变化,为不孕症患者的管理提供临床依据。

方法：选取66例不孕症女性为研究对象,根据甲状腺激素水平将其分为不孕合并甲减组和不孕未合并甲减组,其中,不孕合并甲减组32例,不孕未合并甲减组34例,另外选取体检正常的育龄期妇女34例为对照组,采用化学分光法测定甲状腺激素及甲状腺自身抗体的水平,采用放射免疫分析方法测定血清中IL-6水平,比较三组IL-6水平;另外,在不孕未合并甲减组中,根据血清抗甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulin antibodies,ATG）分为ATG阳性组、ATG阴性组两组;根据血清抗甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase autoantibodies,TPO-Ab）分为TPO-Ab阳性组和TPO-Ab阴性组两组,分别比较各组IL-6水平。Pearson相关分析甲状腺激素、甲状腺自身抗体和血清IL-6D相关性,多元线性回归逐步分析IL-6的危险因素。

结果（1）三组IL-6水平均不相同,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与对照组相比,不孕未合并甲减组患者血清IL-6水平升高（P＜0.01）;与不孕未合并甲减组相比,不孕合并甲减组血清IL-6水平升高（P＜0.01）;

（2）在不孕未合并甲减的女性中,ATG、TPO-Ab阳性患者较阴性患者血清IL-6水平无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）;

（3）不孕症患者血清IL-6水平与游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、ATG、TPO-Ab均呈线性相关,多元线性回归分析调整混杂因素后,IL-6与FT3、FT4的相关性更为显著（P＜0.05）。

参考文献

[1]Thyroid Autoantibodies do not Impair the Ovarian Reserve in Euthyroid Infertile Women:A Cross-Sectional Study[J].Satoko Osuka,Maki Goto,Sachiko Takikawa,Tomoko Nakamura,Tomohiko Murase,Nao Kato,Tomomi Kotani,Fumitaka Kikkawa.Hormone and Metabolic Research.2018(07)

[2]Vitamin D deficiency and high serum IL-6 concentration as risk factors for tubal factor infertility in Chinese women[J].Weiwei Chen,Xianting Jiao,Jun Zhang,Lei Wang,Xiaodan Yu.Nutrition.2018

[3]Higher TSH Levels Within the Normal Range Are Associated With Unexplained Infertility[J].Tahereh Orouji Jokar,Lindsay T Fourman,Hang Lee,Katherine Mentzinger,Pouneh K Fazeli.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolis.2018(2)

[4]The impact of thyroid autoimmunity on IVF/ICSI outcome:a systematic review and meta-analysis[J].Andrea Busnelli,Alessio Paffoni,Luigi Fedele,Edgardo Somigliana.Human Reproduction Update.2016(6)

[5]惠灿灿.不孕症患者甲状腺功能、甲状腺自身抗体与血清IL-6关系的研究[D].安徽医科大学,2019.