人Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于血清PⅢNP、MPO在慢性心力衰竭中的临床意义研究

通过测定慢性心力衰竭患者血清中Ⅲ型前胶原氨基端肽（N-terminal peptide of typeⅢprocollagen,PⅢNP）及髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的水平,分别观察其与各项心功能指标之间的相互关系,探究慢性心力衰竭患者血清PⅢNP、MPO的相关性及其在慢性心力衰竭中的临床意义。

方法:本研究选取心力衰竭病房住院的患者共114例,其中包括CHF组（n=75例）、对照组（n=39例）。所有纳入的患者均在入院后第二日清晨空腹时经肘部抽取静脉血。应用电化学发光免疫的方法进行定量检测患者血清中PⅢNP及N端B型利钠肽原（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-pro BNP）的浓度。运用酶联免疫吸附的检测方法对血清中MPO的浓度进行定量检测。同时所有入选患者均在入院当日由我院经验丰富的超声科医师行心脏彩色多普勒超声检查,准确测量并记录患者的左心室舒张末期内径（Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD）以及左心室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）。

主要应用SPSS 23.0统计软件包对所有获取的数据进行统计学分析,比较两组患者血清PⅢNP及MPO的浓度高低,并分别对其与NT-pro BNP、LVEDD、LVEF各项之间的相关性进行分析同时探究二者之间的有无关联性。结果:1.将CHF组患者血清PⅢNP的水平与对照组进行统计学差异比较,其结果显示PⅢNP的水平在CHF组相对较高,（25.19±8.11ng/ml vs 62.05±26.42ng/ml,P＜0.001）。在CHF组中,关于血清PⅢNP水平的相关性分析结果为,NT-pro BNP、LVEDD水平均与其呈现正相关关系（分别为r=0.349,P=0.002;r=0.335,P=0.003）,而LVEF水平与之呈负相关关系（r=-0.256,P=0.027）。

2.CHF组患者血清MPO水平与对照组相比明显升高,其差异有统计学意义（52.84±10.03ng/ml vs 78.27±12.69ng/ml,P＜0.001）。CHF组患者的血清MPO水平与NT-pro BNP、LVEDD水平呈正相关性（分别为r=0.438,P＜0.001;r=0.405,P＜0.001）,与LVEF水平呈负相关性（r=-0.438,P＜0.001）。3.经Spearman相关性分析,CHF组患者血清MPO与PⅢNP的水平存在正性相关的关系（r=0.283,P=0.014）。

参考文献

[1]Heart Failure.[J].Baman Jayson R,Ahmad Faraz S.JAMA.2020

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[5]张明璇.血清PⅢNP、MPO在慢性心力衰竭中的临床意义[D].大连医科大学,2021.