植物线粒体提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物线粒体提取试剂盒是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒，适用于从植物叶片、块茎或黄花苗中分离线粒体以便进行结构和功能研究。线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化,并通过偶联磷酸化生成ATP,供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的,本试剂盒用简便快速的方法即可在40分钟内提取得到线粒体。

植物线粒体提取试剂盒

植物线粒体提取试剂盒特点：

1.即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2.提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析，也可以用于PCR级别的线粒体DNA和RNA提取。

3.精提利用冷冻超速离心（离心力达40000g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。

应用^[4][5]

用于柑橘线粒体DNA高效提取技术体系的建立及其RAPD分析研究

线粒体是植物细胞的重要细胞器,具有相对独立的遗传物质。大量研究表明,线粒体基因组与真核细胞的抗药性、细胞的生命周期、植物的细胞质雄性不育有关。提取高质量的mtDNA是进行线粒体基因组研究的前提,也是开展植物细胞质雄性不育分子机理研究的先决条件。

本研究对柑橘雄性不育品种江西无核椪柑进行了胚性愈伤组织的诱导;并以江西无核椪柑、黔阳无核、伏令夏橙等为材料建立了柑橘线粒体DNA高效提取技术体系;同时,对所提取的mtDNA进行了RAPD分析。

主要研究结果如下:1、以江西无核椪柑成熟果实中的未发育胚珠为试材,采用MT、MES（MT+500mg/L ME+40 mg/L SAD）、MK（MT+0.5 mg/L KT）和MGS（MT+500 mg/L ME+1mg/L GA3+40 mg/L SAD）4种培养基进行胚性愈伤组织诱导。结果表明在不同培养基上胚性愈伤组织的发生频率不同;麦芽提取物和GA3有利于胚性愈伤组织的发生;暗培养有利于胚性愈伤组织的诱导;在继代培养基中添加5 mg/L的AgNO3有利于小而弱的胚状体基部形成胚性愈伤组织,同时能够抑制胚状体的发生。

2、以7个柑橘品种的胚性愈伤组织为试材,通过差速离心分离出线粒体,蔗糖衬挚法进一步纯化,建立了柑橘线粒体DNA（mtDNA）的快速提取体系。提取的线粒体完整,具有很强的荧光活性。线粒体样经SDS、蛋白酶K、核酸酶处理后用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇处理、乙醇沉淀,得到线粒体DNA（mtDNA）,对提取的mtDNA进行紫外分光光度计分析,A260/A280平均为1.80,A260/A230平均为1.95。0.7%琼脂糖电泳获得清晰、整齐的条带。mtDNA片段在20 kb左右,且无降解。

实验采用差速离心的方法,与通常采用的密度梯度离心法相比,耗时短,对离心机的要求不高,且所提取的mtDNA产率高,结构完整。

3、从30条随机引物中共筛选出14条扩增产物带型清晰、具有较好的多态性的引物,以7个品种的mtDNA为模板进行RAPD分析。7个品种均扩增出较多的条带,呈现出较清晰的多态性,大小分布在250 bp～2000 bp之间。

参考文献

[1]Mitochondrial effects on flower and pollen development[J].Mitochondrion.2005(6)

[2]Unveiling the molecular arms race between two conflicting genomes in cytoplasmic male sterility?[J].Trends in Plant Science.2004(12)

[3]Genetic diversity in European winter triticale determined with SSR markers and coancestry coefficient[J].S.H.Tams,E.Bauer,G.Oettler,A.E.Melchinger.Theoretical and Applied Genetics.2004(7)

[4]Microdissection and molecular manipulation of single chromosomes in woody fruit trees with small chromosomes using pomelo（Citrus grandis）as a model.II.Cloning of resistance gene analogs from single chromosomes[J].D.Huang,W.Wu,L.Lu.Theoretical and Applied Genetics.2004(7)

[5]霍岩.柑橘线粒体DNA高效提取技术体系的建立及其RAPD分析[D].华中农业大学,2008.