小鼠睾酮(T)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠睾酮(T)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中睾酮(T)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被睾酮(T)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的睾酮(T)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求

1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3、细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

小鼠睾酮(T)ELISA试剂盒

操作步骤：

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于定坤丹对大、小鼠前列腺增生模型的影响研究

探究定坤丹对大鼠、小鼠前列腺增生的影响作用。通过对实验动物前列腺重量的测定,计算实验动物的前列腺脏器指数,检测模型大、小鼠血清中雌激素——雌二醇及雄激素——双氢睾酮、睾酮含量,检测实验大鼠前列腺组织匀浆中前列腺酸性磷酸酶活力,观察碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子及其m RNA、细胞凋亡基因Bax、Bcl-2等生长因子在前列腺组织中的表达,从病理学角度观察并描述前列腺、肾脏等脏器的微观改变,基于这些指标的变化,综合性讨论定坤丹对男性常见疾病——前列腺增生的影响作用。

方法:小鼠模型的复制:造模小鼠皮下注射丙酸睾酮5mg/kg,每日1次,连续3周,造前列腺增生模型,同时,每日1次,连续给药3周,各组给予相应药物,用等量的溶媒灌服给予模型及空白对照组,非那雄胺片组给予非那雄胺混悬液（1.25mg/kg）,癃闭舒胶囊组给予癃闭舒胶囊混悬液（450mg/kg）,大、中、小定坤丹剂量组分别给予大、中、小剂量（10.8g/kg、5.4g/kg、2.7g/kg）的定坤丹混悬液。于末次给药后2h,小鼠眼眶取血,分离血清,按照试剂盒说明书测血清中T、DHT、E2水平;取前列腺、附睾、肾等组织,称重,并计算相关脏器指数;光镜下观察前列腺、附睾等脏器的组织形态变化。

大鼠模型的复制:摘除大鼠两边睾丸以去势,待一周大鼠自然恢复后,大鼠给予丙酸睾酮注射液（4mg/kg）,每日1次,连续30d,造前列腺增生模型。模型复制成功后各组给予相应药物,每日1次,连续给药30d:把等量溶媒给予模型及空白对照组,非那雄胺片组给予0.83mg/kg的非那雄胺混悬液,癃闭舒胶囊组给予300mg/kg的癃闭舒胶囊混悬液,大、中、小定坤丹剂量组分别给予大、中、小剂量（7.2g/kg、3.6g/kg、1.8g/kg）的定坤丹混悬液。

于末次给药后2h,眼眶取血,离心,分离血清,按照试剂盒说明书测血清中T、DHT、E2水平;计算前列腺指数;测定前列腺组织匀浆中PACP、NOS、SOD、MDA水平,光镜下观察各组前列腺等脏器的形态变化,观察前列腺组织中b FGF、TGF-β1、EGF、IGF-Ⅰ、细胞凋亡基因Bax、Bcl-2及Ki67的免疫组化表达情况。结果:丙酸睾酮法诱导非去势小鼠前列腺增生模型成功,大、中、小剂量定坤丹组显著降低小鼠前列腺脏器指数;显著降低小鼠血清中T、DHT含量,E2含量显著或明显升高;显著改善小鼠前列腺增生病理变化。

丙酸睾酮法诱导去势大鼠前列腺增生模型成功,大、中、小剂量定坤丹组显著降低大鼠前列腺脏器指数;显著降低大鼠血清中T、DHT含量,E2含量显著或明显升高;大、中、小剂量定坤丹组均可显著降低模型大鼠前列腺中的PACP活力,显著升高TNOS、i NOS水平、TGF-β平均光密度,显著或明显降低大鼠前列腺MDA水平、b FGF、EGF、Bcl-2、Ki-67平均光密度、b FGF m RNA表达,显著或明显升高大鼠前列腺SOD活力、Bax平均光密度、TGF-βm RNA表达。大、中剂量定坤丹组可显著或明显降低模型大鼠前列腺中IGF-I平均光密度,小剂量定坤丹组有降低IGF-I平均光密度的趋势;显著改善小、大鼠前列腺增生病理变化。

参考文献

[1]Systematic review of lower urinary tract symptoms/benign prostatic hyperplasia surgical treatments on men’s ejaculatory function:Time for a bespoke approach?[J].Giancarlo Marra,Paul Sturch,Marco Oderda,Shahin Tabatabaei,Gordon Muir,Paolo Gontero.Int.J.Urol..2016(1)

[2]Phytotherapy of Benign Prostatic Hyperplasia.A Minireview[J].Ester Pagano,Massimiliano Laudato,Michele Griffo,Raffaele Capasso.Phytother.Res..2014(7)

[3]?tiologie und Pathophysiologie der benignen Prostatahyperplasie[J].A.Roosen,C.Gratzke,A.Herrlemann,G.Magistro,F.Strittmatter,P.Weinhold,S.Tritschler,C.G.Stief.Der Urologe.2013(2)

[4]Expression of the IGF Axis Is Decreased in Local Prostate Cancer but Enhanced after Benign Prostate Epithelial Differentiation and TGF-βTreatment[J].The American Journal of Pathology.2011(6)

[5]郭琳.定坤丹对大、小鼠前列腺增生模型的影响[D].河南中医药大学,2016.