人蛋白质二硫键异构酶(PDI)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人蛋白质二硫键异构酶(PDI)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中蛋白质二硫键异构酶(PDI)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中浓度，或者与CUTOFF值相比较，从而判定标本阴阳性。

蛋白质二硫键异构酶(PDI)

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算:以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于妊娠早期血蛋白质二硫键异构酶A3自身抗体的表达对自身免疫甲状腺炎妇女流产发生的影响研究

对妊娠早期AIT孕妇血清PDIA3Ab进行检测分析研究,探讨PDIA3Ab对流产风险的影响,并且明确PDIA3Ab是否参与AIT相关性流产。

方法:收集孕早期亚临床甲状腺功能减退孕妇调查（SHEP）项目I期中符合非缺铁、尿碘提示处于碘适量状态、无任何药物干预下甲功正常,并排除了既往有糖尿病史、高血压病史、子痫病史、本次妊娠中存在前置胎盘、早产、人工流产原因不明者及除自身免疫性甲状腺炎（AIT）外的其他自身免疫性疾病史的青年（年龄<45岁）孕妇360例。ELISA法检测其妊娠早期血清PDIA3Ab水平,同时已记录受试者年龄、孕周、吸烟史、饮酒史等基本信息,及其妊娠早期的腹围、体质指数（BMI）、血清铁蛋白（SF）、尿碘（UIC）、促甲状腺激素（TSH）、游离甲状腺激素T4（FT4）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）及甲状腺球蛋白抗体（TgAb）水平。

对孕妇的随访一直持续到出现妊娠结局为止,按孕妇是否发生过自发流产及是否为AIT孕妇分为AIT流产组和AIT非流产组,及非AIT流产组和非AIT非流产组。以AIT流产组为基准,以年龄、孕周因素为匹配条件,按照1:2比例匹配了AIT非流产组及非AIT流产组,再以非AIT流产组为基准,按照1:2比例匹配了非AIT非流产组,对AIT孕妇及非AIT孕妇流产相关因素进行比较分析。

结果:与AIT非流产孕妇相比较,AIT孕妇发生过自发流产者血清PDIA3Ab水平显著升高。进一步进行Logistic回归分析显示血清PDIA3Ab水平升高是导致甲功正常、非缺铁、尿碘适量的青年AIT孕妇发生自发流产的独立危险因素;与非AIT非流产孕妇相比较,非AIT孕妇发生过自发流产者妊娠早期腹围显著降低、尿碘、血清铁水平显著升高,并没有发现血清PDIA3Ab水平在两者之间有显著不同。进一步进行Logistic回归分析,结果发现,腹围偏小、尿碘偏高是导致非AIT青年孕妇自发流产的独立危险因素,而血清PDIA3Ab水平变化并不是非AIT青年孕妇发生自发流产的独立危险因素。

并采用Spearman等级相关系数检验,进一步比较AIT组的血PDIA3Ab水平与血FT4、TSH、TPOAb、TgAb水平的关系,结果提示在AIT流产组中,血PDIA3Ab水平与血TPOAb水平正相关。

结论:在甲功正常、碘适量、非缺铁的青年妇女中:AIT患者妊娠早期血PDIA3Ab水平的升高是导致其发生自发流产的独立危险因素;而且在AIT流产孕妇中,血PDIA3Ab水平和其血TPOAb水平呈显著的正相关。

参考文献

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[2]Identification of candidate synovial membrane biomarkers after Achyranthes aspera treatment for rheumatoid arthritis[J].Wen Zheng,Xianghong Lu,Zhirong Fu,Lin Zhang,Ximin Li,Xiaobao Xu,Yina Ren,Yongzhuang Lu,Hongwei Fu,Jingkui Tian.BBA-Proteins and Proteomics.2015

[3]Protein disulfide isomerase–endoplasmic reticulum resident protein 57 regulates allergen-induced airways inflammation,fibrosis,and hyperresponsiveness[J].Sidra M.Hoffman,David G.Chapman,Karolyn G.Lahue,Jonathon M.Cahoon,Gurkiranjit K.Rattu,Nirav Daphtary,Minara Aliyeva,Karen A.Fortner,Serpil C.Erzurum,Suzy A.A.Comhair,Prescott G.Woodruff,Nirav Bhakta,Anne E.Dixon,Charles G.Irvin,Yvonne M.W.Janssen-Heininger,Matthew E.Poynter,Vikas Anathy.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2015

[4]Structures and functions of protein disulfide isomerase family members involved in proteostasis in the endoplasmic reticulum[J].Masaki Okumura,Hiroshi Kadokura,Kenji Inaba.Free Radical Biology and Medicine.2015

[5]刘爽.妊娠早期血蛋白质二硫键异构酶A3自身抗体的表达对自身免疫甲状腺炎妇女流产发生的影响[D].中国医科大学,2019.