兔环磷酸腺苷(CAMP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

兔环磷酸腺苷(CAMP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中环磷酸腺苷(CAMP)的含量。

原理：兔环磷酸腺苷(CAMP)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被兔环磷酸腺苷(cAMP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的兔环磷酸腺苷(cAMP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

兔环磷酸腺苷(CAMP)ELISA试剂盒

样品的准备和保存

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

操作程序

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断:

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于高压电烧伤大鼠核因子κB（NF-κB）和环磷酸腺苷（cAMP）变化及乌司他丁的干预作用研究

探查高压电烧伤对大鼠血清中NF-κB及cAMP含量的影响及乌司他丁（UTI）对其的干预作用。

方法:1实验动物:采用随机数表,将从河北医科大学实验动物中心购买的健康成年雄性SD大鼠180只（体重220-310g,证书编号:1411023）,以随机区组设计法平均分成三组,即假高压电烧伤组（简称为对照组）、高压电烧伤组（简称为电伤组）、高压电烧伤后乌司他丁治疗组（简称为治疗组）,每组60只。再将每组中60只大鼠随机分为高压电伤前15min、高压电伤后5min、高压电伤后1h、高压电伤后2h、高压电伤后4h、高压电伤后8h,6个不同时相组,每组10只。各组分别编号,分笼饲养。

2药物及大鼠准备工作:按实验需求,配比所需麻醉药品及乌司他丁溶液浓度,将大鼠标号,称重,按体重计算所需药品用量,并记录数据。

3制高压电烧伤大鼠模型:连接实验电路,检查实验电路确定电路各元件连接安全且正确。按计算量给予实验大鼠腹腔内注射水合氯醛溶液（即0.3ml/100g）麻醉大鼠,注意麻醉深度。将麻醉成功的大鼠取仰卧位,稳定固定在电路绝缘板上,并于左前肢及右后肢分别连接大小相等的1cm×1cm电极夹片,左前肢连接火线为电流入口,右后肢连接零线为电流出口。接通电源后将调压器电压调整为2k V,闭合电路电闸,对实验大鼠持续实施接触性高压电击,时长为3s,断开电闸,关闭电源。按照实验要求,对空白对照组实施的操作方法同电伤组,但不接通电源,即给予假电。给予电伤后的高压电击组及假高压电击组大鼠腹腔内注射生理盐水（5ml/kg）。给予电伤后治疗组大鼠腹腔内注射UTI（2万单位/kg即5ml/kg）。以上各组分别记录电击时时间点。

4标本采集与保存:按实验要求,先后对相应时相组内大鼠进行采血。操作过程:麻醉大鼠,方法同前。大鼠被麻醉成功后,取仰卧位稳定固定在动物解剖台上;开胸,直视下用采血针心尖采血,置于3ml粉头真空促凝管内。每只大鼠可收集全血约6ml。将所取血液样本静置约30min,待血清析出后放入离心机内离心,要求:转速:3000转/min时长:10min。吸管吸取离心后上层血清,置于2ml Eppendorf管中,于-70℃冰箱保存,待检。

5指标检测:分别检测各组各时相大鼠血清中cAMP及NF-κB浓度;本实验采用ELISA双抗夹心法,测得各指标表达量的OD值,再根据试剂说明由OD值换算得出血清中cAMP及NF-κB浓度。

6数据分析:对本次实验所得数据采用SPSS13.0统计软件进行分析。均以均数±标准差（sx±）表示实验所得数据。行两因素析因设计资料的方差分析,多重比较采用LSD-t检验,设定P<0.05为显著性差异。

结果:环磷酸腺苷（cAMP）1.1电伤组大鼠环磷酸腺苷（cAMP）总体含量高于空白对照组（F=264.71,P<0.05）;电伤后不同时相组大鼠血清中cAMP含量呈现显著差异（F=17.73,P<0.05）,且随时间呈现出逐渐增高趋势;电伤后各时相cAMP含量均高于伤前（P<0.05）。

参考文献

[1]Replacement of specific coagulation factors in patients with burn:A review[J].Athina Lavrentieva.Burns.2012

[2]Puerarin attenuates endothelial insulin resistance through inhibition of inflammatory response in an IKKβ/IRS-1-dependent manner[J].Fang Huang,Kang Liu,Hang Du,Junping Kou,Baolin Liu.Biochimie.2012(5)

[3]Constitutive NF-κB activity regulates the expression of VEGF and IL-8and tumor angiogenesis of human glioblastoma[J].Tong-Xin Xie,Zhibo Xia,Nu Zhang,Weida Gong,Suyun Huang.Oncology Reports.2010(3)

[4]RBC Adhesion to Vascular Endothelial Cells:More Potent than RBC Aggregation in Inducing Circulatory Disorders[J].SAULYEDGAR,DHANANJAY K.KAUL,GREGORYBARSHTEIN.Microcirculation.2010(7)

[5]张涵.高压电烧伤大鼠核因子κB(NF-κB)和环磷酸腺苷(cAMP)变化及乌司他丁的干预作用[D].河北医科大学,2016.