NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞来源于一个淋巴结转移，患者接受了初期放疗。NCI-H1299细胞均一性的部分缺失p53蛋白，并缺少p53蛋白表达。NCI-H1299细胞可以合成0.1pmol/毫克蛋白的NMB蛋白，而不合成促胃液释放肽(GRP)。

NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞

培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于虎眼万年青对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

虎眼万年青是一种天然中草药植物,其多种化学成分已被证实具有强效抗癌活性,探讨虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖抑制、凋亡作用及机制。

方法：应用MTT法测定不同浓度、不同时间段虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对人肺腺癌H1299细胞株的增殖抑制作用;倒置显微镜观察肺癌H1299细胞形态变化,荧光显微镜观察H1299细胞凋亡变化;流式细胞术观察虎眼万年青醇提物对H1299细胞的凋亡诱导作用;Western Blot检测经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Bad蛋白）的表达情况;实时荧光定量法（RT-PCR）检测经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、Bad）的表达情况。

结果：MTT结果显示,虎眼万年青鳞茎及叶醇提物作用于人肺腺癌H1299细胞后,48h及72h浓度为0.5、1、2、5、10mg/mL时细胞活性与空白对照组相比明显降低,且差异具有统计学意义（P<0.05、P<0.01）;溶媒组（DMSO<0.1%）与空白对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。倒置显微镜显示加药组细胞生长明显受抑制,细胞形态发生改变;荧光显微镜及流式细胞术显示,虎眼万年青鳞茎及叶醇提物正丁醇相可促进H1299细胞凋亡;Western Blot结果显示经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞中Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白无明显变化、Bad蛋白表达升高,Bax/Bcl-2比值升高;实时荧光定量法（RT-PCR）检测结果显示经虎眼万年青处理后H1299细胞中Bcl-2 mRNA表达下降、Bax mRNA无明显变化、Bad mRNA表达升高,Bax/Bcl-2比值升高。

结论1.体外实验表明,虎眼万年青叶及鳞茎醇提物均可抑制人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及促进凋亡,且具有浓度依赖性;2.Bcl-2家族部分基因及蛋白共同参与虎眼万年青叶及鳞茎醇提物诱导H1299细胞凋亡的过程。

参考文献

[1]Cancer statistics in China,2015[J].Wanqing Chen,Rongshou Zheng,Peter D.Baade,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Freddie Bray,Ahmedin Jemal,Xue Qin Yu,Jie He.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2016(2)

[2]Lung cancer risk among bricklayers in a pooled analysis of case–control studies[J].Dario Consonni,Sara De Matteis,Angela C.Pesatori,Pier Alberto Bertazzi,Ann C.Olsson,Hans Kromhout,Susan Peters,Roel C.H.Vermeulen,Beate Pesch,Thomas Brüning,Benjamin Kendzia,Thomas Behrens,Isabelle Stücker,Florence Guida,Heinz‐Erich Wichmann,Irene Brüske,Maria Teresa Landi,Neil E.Caporaso,Per Gustavsson,Nils Plato,Lap Ah Tse,Ignatius Tak‐sun Yu,Karl‐Heinz J?ckel,Wolfgang Ahrens,Hermann Pohlabeln,Franco Merletti,Lorenzo Richiardi,Lorenzo Simonato,Francesco Forastiere,Jack Sie.Int.J.Cancer.2015(2)

[3]Comparison between concurrent and sequential chemoradiation for non?smallcell lung cancer in vitro[J].Seo?Young Song,Amit Das,John Minna.Oncology Letters.2014(2)

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[5]王瑜.虎眼万年青对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖与凋亡的影响及机制研究[D].延边大学,2017.