亚细胞结构线粒体提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

亚细胞结构线粒体提取试剂盒是用于快速便捷地分离培养细胞线粒体的试剂盒。

试剂盒在分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于研究细胞色素c等线粒体蛋白向胞浆的释放。

使用本试剂盒分离获得的线粒体纯度较高，并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能。因此本试剂盒分离得到的线粒体可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。

本试剂盒分离得到的线粒体也可以被试剂盒中的线粒体裂解液或其它适当裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。

亚细胞结构线粒体提取试剂盒

本试剂盒提供了线粒体制备过程中匀浆程度的重要判断指标，即台盼蓝染色，使分离得到的线粒体的质量更加有保证。台盼蓝染色液为选用试剂，在实验条件成熟后可以不必使用。

本试剂盒提供了蛋白酶抑制剂PMSF，使匀浆时蛋白酶的活性被适当抑制，这样在获得线粒体的同时还可以获得有时有用的去除了大量线粒体的蛋白，在进行蛋白或酶活分析时可以作为对照。

使用方法：

1.对于贴壁细胞:细胞刮刮下细胞，600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2.对于悬浮细胞:600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

3.加入适量的预冷的PBS重悬细胞,600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

4.加入胞浆蛋白提取试剂A，振荡混匀数秒，使细胞完全悬浮并分散开，放置在冰上孵育10-15分钟。

5.加入胞浆蛋白提取试剂B,振荡混匀5秒，冰上孵育1分钟。(注意：若胞核蛋白中掺杂胞浆蛋白，可适当延长此步骤的孵育时间，一般可以延长1-5分钟。）

6.振荡混匀5秒，16000g离心5分钟。

7.立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。

8.加入胞核蛋白提取试剂，振荡混匀数秒，使沉淀完全悬浮并分散开，放回冰浴中孵育40分钟，期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒，16000g离心5分钟。

9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。

应用^[4][5]

用于亚细胞结构蛋白离心柱式提取技术研发研究

研究拟开发一种基于离心柱的柱式蛋白提取新技术,开发柱式提取法及配套试剂,并开发了对应亚细胞结构蛋白分离提取试剂盒产品。

在柱式提取法的基础上,结合表面带正电荷的SiO2纳米粒,能通过电荷力亲和提取细胞膜,实现膜蛋白高纯度的提取。（1）通过扫描电镜对加压烧结成形的离心柱滤芯多孔材料微孔和表面形貌进行表征;（2）进行总蛋白提取和膜蛋白提取,开发优化与柱式提取法配套的基础提取试剂;（3）在基础试剂上,以细胞和组织的膜蛋白,细胞核-胞浆蛋白,线粒体蛋白为目标,以市售试剂盒为对照组,优化基础试剂和提取方案,开发对应的亚细胞结构蛋白分离提取试剂盒;（4）以细胞膜为提取目标,基于正负电荷结合原理,制备了表面带正电荷的SiO2纳米粒,通过Zate电位仪及粒径分析,对其进行表征。

结合柱式提取法后,对比市售试剂盒,验证其能否进行高纯度的提取膜蛋白。实验结果表明:通过离心惯性作用配合复杂孔道,离心柱能有效的裂解细胞,并除去基因组DNA。开发的几种亚细胞结构蛋白分离提取试剂盒,在提取的蛋白浓度及蛋白种类方面达到市售优秀进口试剂盒水平,超过了目前广泛使用的RIPA提取法以及相应的试剂盒。制备的表面带正电荷的SiO2纳米粒,能较长时间带有正电荷,并且粒径更小,结合柱式法后能高纯度的提取膜蛋白。

与传统法对比,柱式提取法实验操作简单,提取时间短,可小样本提取,不需要超速离心机,提取效果优于市售试剂盒。在结合正电荷SiO2纳米粒后,能高纯度提取膜蛋白,对比抗体纳米磁珠,具有更低的成本,不需要专门的磁场分离设备,并且易于保存。

参考文献

[1]Subcellular fractionation of frozen skeletal muscle samples.[J].Dias Pedro Rafael Firmino,Gandra Paulo Guimar?es,Brenzikofer René,Macedo Denise Vaz.Biochemistry and cell biology=Biochimie et biologie cellulaire.2020(2)

[2]Mass Spectrometry-Compatible Subcellular Fractionation for Proteomics.[J].Masuda Takeshi,Sugiyama Naoyuki,Tomita Masaru,Ohtsuki Sumio,Ishihama Yasushi.Journal of proteome research.2020(1)

[3]An improved method for isolation of mitochondria from cell lines that enables reconstitution of calcium-dependent processes[J].Masaaki Ishii,Gyda Beeson,Craig Beeson,B?rbel Rohrer.Analytical Biochemistry.2019

[4]Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue[J].W.Brad Hubbard,Christopher L.Harwood,Paresh Prajapati,Joe E.Springer,Kathryn E.Saatman,Patrick G.Sullivan.Scientific Reports.2019(1)

[5]李樑.亚细胞结构蛋白离心柱式提取技术研发[D].重庆大学,2021.